Создание вирусом Эпштейна-Барра роста трансформированных лимфобластоидных клеточных линий

Общая цель данной процедуры — получение линий лимфобластов, трансформированных вирусом Эпштейна-Барр (LCL), из B-лимфоцитов человека. Это достигается путем предварительного выделения мононуклеарных клеток периферической крови из крови человека.

Затем клетки инфицируют вирусом Эпштейна-Барр в присутствии FK 5 0 6 и иммуносупрессивных препаратов. Через три-четыре дня после заражения вирусом Эпштейна-Барр появляется субпопуляция клеток, характеризующаяся высоким уровнем экспрессии CD 23 и положительным результатом по CD 58, которая, как ожидается, подвергнется пролиферации. Количество CD 23-high CD 58-положительных клеток можно определить методом проточной цитометрии в качестве предиктора успешного исхода. Пролиферирующие клетки могут быть дополнительно идентифицированы микро- и макроскопически по кластерам линий лимфобластов, которые образуются в успешно трансформированных клеточных культурах.

Заключительным этапом является экспансия линий лимфобластных клеток для криоконсервации. В моей лаборатории мы создаем линии лимфобластных клеток (LCL), чтобы изучить взаимодействия между организмом хозяина и вирусом Эпштейна — Барр. Линии лимфобластных клеток также представляют широкий общий интерес для научного сообщества, в частности для вирусологов, иммунологов и онкобиологов.

В качестве постдокторанта в лаборатории Macintosh я продемонстрирую процедуру создания линий лимфобластоидных клеток. После забора 10 мл крови у донора поместите гепаринизированную кровь в коническую пробирку объемом 50 мл, а затем разведите её в соотношении 1:2. Добавьте в пробирку 20 мл PBS комнатной температуры, затем создайте подслой из 15 мл среды для разделения лимфоцитов FICO HIA и центрифугируйте кровь при 225 ×g без торможения при комнатной температуре в течение 30 минут для формирования градиента.

Затем удалите лейкоцитарный слой (buffy coat) и перенесите его в новый конический тубус объемом 50 миллилитра. Доведите объем до 50 миллилитра с помощью PBS, после чего осадите клетки при 600 ×g в течение 10 минут. Слейте супернатант, ресуспендируйте осадок в 50 миллилитрах PBS и промойте клетки еще два раза при тех же условиях.

Теперь ресуспендируйте клетки в одном миллилитре полного RPMI. Я использую пять микролитров суспензии клеток для приготовления разведения 1:10 в красителе трипан блю и для подсчета живых клеток с помощью гемоцитометра, затем использую полный RPMI для корректировки объема, чтобы получить концентрацию клеток 2 × 10⁶ клеток на миллилитр, и переношу клетки в культуральный флакон площадью 25 см².

Чтобы подготовить клетки к заражению вирусом Эпштейна-Барр, добавьте в флакон для культивирования тканей FK 5 0 6 до конечной концентрации 20 M. Затем поместите флакон в инкубатор с 5% углекислого газа при 37 °C на один час. Когда инкубация клеток будет почти завершена, быстро разморозьте аликвоту вируса Эпштейна-Барр, полученную из клеток B 95 8. Затем извлеките флакон из инкубатора и добавьте вирус Эпштейна-Барр к клеткам в разведении 1:10; встряхните флакон, чтобы перемешать вирус Эпштейна-Барр в растворе, а затем поставьте флакон вертикально в инкубатор, плотно закрыв крышку, но оставив её слегка приоткрытой (если используется флакон без вентиляционного фильтра), на две-три недели перед экспансией культуры для криоконсервации.

Через неделю после eps (инфицирования вирусом Эпштейна-Барр) при световой микроскопии становятся видны скопления клеток, что продемонстрировано на данном репрезентативном изображении ранних микроскопических кластеров. Со временем микроскопические кластеры увеличиваются, и в колбе начинают макроскопически наблюдаться конгломераты, как показано на данном рисунке, где видны более крупные кластеры LCL; в этот момент необходимо подкормить клетки, удвоив объем питательной среды в культуральной колбе на 12-й день. Когда культуральная среда желтеет, что обычно происходит примерно раз в неделю, наступает время для подкормки с целью экспансии клеток и увеличения объема культуры в два-три раза.

Используя полноценную среду RPMI, в течение следующих нескольких недель расширьте культуру до 70–100 миллилитров в колбе объемом 75 квадратных сантиметров для получения клеток для криоконсервации; успешный результат прогнозируется по наличию CD 23 и высокого уровня CD 58-положительных клеток, как показано на этой диаграмме рассеяния; примерно от 2 до 3% живых клеток на третий-четвертый день после воздействия вируса Эпштейна-Барр имеют такой профиль; другие субпопуляции CD 23-положительных, CD 23-отрицательных, CD 58-положительных и CD 58-отрицательных клеток, наблюдаемые после воздействия вируса Эпштейна-Барр, демонстрируют минимальную пролиферацию, а неинфицированные клетки или клетки, инфицированные неиммортализирующим штаммом вируса Эпштейна-Барр, не проявляют высокого уровня CD 23.

CD 58-положительные клетки. Клетки также можно визуализировать с помощью световой микроскопии. Как упоминалось ранее, в течение недели после заражения вирусом Эпштейна-Барр в колбе при световой микроскопии видны небольшие скопления клеток.

По мере течения времени и развития клеток в LCL микроскопические кластеры увеличиваются в размере, так что в колбе становятся макроскопически видны скопления. Хорошо. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять мононуклеарные клетки периферической крови из крови человека и создавать клеточные линии лимфобластов, трансформированных вирусом Эпштейна-Барр, из B-клеток человека, хотя метод создания линий лимфобластов был описан и другими лабораториями.

Преимущество нашего протокола заключается в том, что он предоставляет исследователям метод прогнозирования успешного результата уже через три-четыре дня после инфицирования B-клеток вирусом Эпштейна — Барр.