Вывод Обогащенный олигодендроцитов культур и олигодендроцитов / Нейрон Myelinating сотрудничества культур от Послеродовые мышей тканей

Здравствуйте, я Райан О'Мара, аспирант из Университета Оттавы и Исследовательского института больницы Оттавы. В этом протоколе будут описаны методы получения обогащенных популяций клеток-предшественников олигодендроцитов у мышей, которые могут быть дифференцированы отдельно или в сочетании с ганглиозными нейронами дорсального корешка мыши для получения миелинизирующих холодовых культур. Начнем с краткого обзора процедуры.

Неонатальные мышиные куртины диссоциированы и усажены в колбы Т 25. После периода культивирования в течение девяти дней на основании колбы образуется монослой астроцитов, на вершине которого происходит пролиферация клеток-предшественников олигодендроцитов. Затем клетки предшественников олигодендроцитов получают и очищают и впоследствии могут дифференцировать в зрелые олигодендроциты в обогащенной культуре.

Если желательны миелинизирующие сокультуры. Ганглиозные нейроны корня Doce от P 5 до P 10 мышей культивируются наряду со смешанными глиальными культурами. В течение девяти дней эти нейроны образуют плотное слой нейритов, на котором могут быть засажены клетки-предшественники олигодендроцитов.

Это позволяет олигодендроцитам опосредованно обернуть нейриты, что приводит к миелинизирующей культуре холода. Сначала целые мозги от P нуля до P двух мышей помещают в ледяную МЕМ и переносят в микроскоп для вскрытия с помощью скальпеля, прорезанного через менингеальный слой каждой коры в продольном направлении, затем отрывают мозговые оболочки от нижележащей коры. Далее удалите обонятельные луковицы вентральной стороной мозга вверх.

Сделайте глубокие продольные разрезы там, где кора встречается с вентральным головным мозгом Спинной стороной вверх отрежьте кору, затем разрежьте корди примерно на четыре части каждая. Перенесите кортикальные мышцы в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, содержащую 350 микролитров ледяного воздуха. MEM на мозг.

Мозги одного и того же генотипа объединены в одной пробирке, так что для четырех мозгов потребовалось бы 1400 микролитров MEM. Как только вскрытие будет завершено, переместите собранные мозги в водяную баню при температуре 37 градусов на три минуты. Затем в капюшоне для стерильных тканей пропустите кусочки мозга через наконечник пипетки P 1000, чтобы разбить их на более мелкие части.

Добавьте 75 микролитров предварительно подогретого OPC Pap pain per brain в коническую трубку. Затем выдерживать на водяной бане 37 градусов в течение 20 минут. Переворачивание трубки каждые две минуты для предотвращения агрегации тканей.

Как только инкубация будет завершена, добавьте два миллилитра смешанной глиальной культуры. Среда на мозг для переваривания, дать настояться 10 минут. Через 10 минут разложите тканевую суспензию по пять миллилитровых пластиковых трубок.

Количество пробирок должно соответствовать количеству мозгов в препарате с помощью пламени Польская стеклянная пастбищная пипетка сначала медленно татирует содержимое каждой пробирки, затем с нарастающей интенсивностью по мере того, как кусочки начинают диссоциировать. Прекратите три-рейтинг, как только в суспензии не останется видимых кусков ткани. Сформируйте содержимое каждой пробирки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую четыре миллилитра смешанной глиальной культуры.

Среда для каждого мозга после осторожного переворачивания трубки несколько раз, аликвотируйте клеточную суспензию в конические пробирки объемом 15 миллилитров. Количество пробирок должно совпадать с количеством мозгов в препарате: центрифугировать пробирки при 300-кратной гравитации в течение пяти минут и ресуспендировать гранулы в одном миллилитре смешанной глиальной питательной среды. Добавьте ресуспендированные клетки из каждой конической пробирки в покрытые поли-L-лизином колбы Т-25, которые были предварительно уравновешены пятью миллилитрами смешанных глиальных культуральных сред.

Количество колб должно быть равно количеству расчлененных мозгов, инкубировать колбы, а при температуре 37 градусов инкубировать при 8,5% СО2. Через три-четыре часа клетки должны прилипнуть к субстрату. Тем не менее, в среде будет сохраняться много мусора, что может отрицательно сказаться на жизнеспособности клеток.

Чтобы избежать этого, по возможности замените среду через три-четыре часа свежей средой для смешанных глиальных культур. Это изменение среды удаляет большую часть клеточного мусора. На следующий день.

На дне колбы должно быть видно много ячеек. На третий день на основании колбы должен образоваться монослой астроцитов. На этом этапе выполните замену среды на две трети, удалив четыре миллилитра среды и добавив обратно четыре миллилитра свежей среды.

Этот шаг следует повторять каждые три дня. На шестой день должен быть хорошо виден монослой астроцитов, поверх которого происходит пролиферация клеток-предшественников олигодендроцитов. На этом этапе добавьте в питательную среду инсулин в конечной концентрации 5 мкг/миллилитр на девятый день, клетки-предшественники олигодендроцитов готовы к отделению от монослоя астроцитов.

Для этого поместите колбы на орбитальный шейкер и инкубатор с 5%-ным содержанием СО2. Дайте колбе приравняться к настоящему инкубатору в течение одного часа. Затем встряхивайте ячейки при 50 об/мин в течение 45 минут.

На этом этапе удаляется множество слабо прикрепленных загрязняющих клеток. Выполните полную смену среды, удалив всю среду и добавив обратно четыре миллилитра свежей питательной среды. Установите колбу в инкубатор с 5% содержанием CO2 и дайте выровняться в течение трех часов.

На трехчасовой отметке проверьте окраску питательных сред. Питательная среда должна быть красного цвета, что указывает на сбалансированный pH. Если цвет ближе к оранжевому или фиолетовому, отрегулируйте уровень CO2 в инкубаторе соответствующим образом.

Поддержание сбалансированного pH важно для выживания клеток-предшественников олигодендроцитов во время ночного встряхивания. Как только будет достигнут сбалансированный pH, встряхивайте колбу со скоростью 220 об/мин в течение примерно 16 часов. На следующее утро извлеките колбу из шейкера и переложите среду из колб в 10-сантиметровые чашки для культуры тканей.

Эти посуды послужат средствами для дальнейшей очистки клеток-предшественников олигодендроцитов путем дифференциальной адгезии. Каждая посуда должна получать среду из двух колб, инкубировать посуду при 5% СО2 в течение 30 минут. На 15-минутной отметке слегка подтолкните каждое блюдо, чтобы предотвратить прилипание клеток-предшественников олигодендроцитов к пластику.

После 30-минутной инкубации осмотрите чашки под контрастом фаз. Клетки-предшественники олигодендроцитов проявляются в виде небольших скоплений клеток. Некоторые из этих клеток могли прилипнуть к тарелке.

Отделите прилипшие клетки-предшественники олигодендроцитов из чашки путем легкого перемешивания. Будь осторожен. Чрезмерное перемешивание может привести к разрыхлению загрязняющих типов клеток.

Перенесите суспензию клеток в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при 300-кратном весе силы тяжести в течение пяти минут. Осторожно поддержите гранулу с помощью наконечника для пипетки P 1000. После подсчета наконечника пипетки P 200 клетки с помощью гемоцитометра очищенные олигодендроциты могут быть помещены на покрытые ламинатом покровные листы для дифференцировки в обогащенные культуры олигодендроцитов в первый день.

После посева обогащенные клетки-предшественники олигодендроцитов имеют относительно простую морфологию, распространяющуюся лишь на несколько процессов. К третьему дню дифференцирующие олигодендроциты расширили многочисленные процессы, напоминающие незрелые олигодендроциты. К шестому дню олигодендроциты удлиняются как пленчатые листы в любой момент этого времени.

Покровные стекла курса могут быть зафиксированы и обработаны для иммуноцитохимии. Вместо того, чтобы засеивать очищенные клетки-предшественники олигодендроцитов на покровных листках, покрытых ламинином, их можно засеять на заросли нейритов ганглия дорсального корня для получения миелинизирующих сокультур. В следующем разделе будут описаны методы создания этих культур.

Для начала изолируйте целые шипы от P 5 до P 10 мышей и перенесите их в диссекционный микроскоп с помощью диссекционных ножниц. Разрежьте вентральную медиальную область позвоночника в продольном направлении. Аккуратно удалите ганглии корешков дорсы или ДРГ с тонким наконечником в четыре этапа.

Переложите ганглии в буферный раствор соли Хэнка в чашке Петри. Обрежьте любые ДРГ от их чрезмерно длинных корней. Использование широкого наконечника для пипетки кабана P 1000.

Переложите ганглии в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Держите трубку на льду, пока все мыши не будут обработаны. Когда изоляция DRG будет завершена, центрифугируйте пробирку при гравитации, примерно в 300 раз превышающей ее.

Перенесите трубку в колпак для стерильной культуры тканей и удалите наднат. Добавьте в тюбик 500 микролитров предварительно подогретого папина DRG и выдерживайте на водяной бане при температуре 37 градусов в течение 10 минут. Когда разложение пепана будет завершено центрифугой, затем замените раствор папина.

С 500 микролитрами прогретой коллагеназы раствор выдерживают при 37 градусах в течение 10 минут. Повторите этап центрифугирования и замените раствор коллагеназы А одним миллилитром питательной среды DRGN. После нашего заключительного этапа центрифугирования добавьте один миллилитр среды DRGN и с помощью пламени отполируйте стеклянную пастбищную пипетку три.

Сначала оценивайте ганглии медленно, затем с нарастающей интенсивностью, когда ткань начинает диссоциировать. Как только фрагменты ткани больше не будут видны, перенесите клеточную суспензию в чашку Петри, содержащую семь миллилитров среды DRGN. Инкубируйте чашку и инкубатор при температуре 37 градусов при концентрации CO2 8,5% в течение одного с четвертью часа.

После такой инкубации понаблюдайте за чашкой Петри. При фазовом контрасте нейроны DRG проявляются как клетки с большим телом. Многие загрязняющие клетки должны быть прочно приклеены к чашке Петри.

Переложите среду в коническую трубку объемом 15 миллилитров и промойте чашку четырьмя миллилитрами среды DRGN, чтобы собрать оставшиеся нейроны. Центрифугируйте коническую пробирку при 300-кратном давлении в течение пяти минут. Повторно суспендируйте полученную гранулу и 500 микролитров среды DRGN.

Подсчитайте клетки с помощью HEO цитометра. Обязательно подсчитайте засеянные нейроны DRG всего от 30 до 50 000 нейронов на 12-миллиметровый покровный лист с ламинированным покрытием в одном миллилитре медиакультуры DRGN. Клетки в инкубаторе для культур тканей с содержанием 8,5% CO2.

На следующее утро выполняйте полную замену среды путем замены среды DRGN на среду ol с добавлением 10 микромолярных FUD R каждый второй день. После этого выполните смену среды на три четверти с помощью ОЛ-среды, дополненной FUD r При исследовании под фазово-контрастным микроскопом в первый день нейроны начали удлинять несколько процессов. На третий день нейронные процессы удлиняются.

На шестой день образовался слой нейритов, состоящий из множества перемешанных процессов. На девятый день этот слой нейритов увеличился в плотности и готов к приему олигодендроцитов путем выращивания смешанных культур мозга. Наряду с культурами нейронов, клетки-предшественники олигодендроцитов могут быть очищены на девятый день культивирования нейронов.

Затем их можно усадить на нейритовые кровати. Добавив 50 000 клеток в каждую лунку чашки на 24 лунки. На шестой день можно увидеть, как клетки, напоминающие олигодендроциты, взаимодействуют с нейронами DRG.

Эти культуры теперь могут быть зафиксированы и обработаны для иммуноцитохимии. Когда культуры обогащенных олигодендроцитов мечутся антителами против маркеров олигодендроцитов, обнаруживаются иммунологически положительные клетки NG two mag и MVP, демонстрирующие стадийно-специфическую морфологию. Эти культуры возникают как популяция двух положительных предшественников олигодендроцитов НГ и в течение шести дней дифференцировки продуцируют магположительные зрелые олигодендроциты.

Когда SDS проводят на лизатах, полученных из культур, обогащенных олигодендроцитами, можно увидеть, что олигодендроциты экспрессируют CNPP и MVP в течение шести дней. При рассмотрении нейронов DRG до добавления олигодендроцитов на девятый день обнаруживаются плотные Taj-1 и нейрофиламент-положительные нейритные пласты. На шестой день совместного культивирования нейронов DRG олигодендроцитов можно увидеть, как многие олигодендроциты с положительными МБП взаимодействуют с нейронами при более высоком увеличении.

Видно, что олигодендроциты оборачивают эти невриты положительной мембраной MBP, напоминающей миелинизацию, цифровое увеличение показывает степень перекрытия положительной мембраны MVP на положительном нейрофиламентном процессе. Здравствуйте, меня зовут Скотт Райан, я учусь в докторантуре Научно-исследовательского института больницы Оттавы. Эти методы обеспечивают средства для создания систем совместного культивирования лиги, эндоцитов и нейронов DRG у мышей.

Этот метод ценен для изучения как экспериментально индуцированных, так и трансгенных моделей миелинизирующего заболевания. Он также эффективен для скрининга новых терапевтических соединений.