Мониторинг убиквитин-протеасомной активности в живых клетках с помощью Degron (DGN)-дестабилизировали зеленого флуоресцентного белка (GFP)-Reporter на основе белков

Общая цель данной процедуры — измерение активности протеасомы в живых клетках с использованием слиянного белка GFP-Deron. Сначала клонируйте специально синтезированные олигонуклеотиды для Deron и Deron со сдвигом рамки считывания. Введите вектор P-E-G-F-P-C 1 и следуйте протоколам системы Gateway от Vitrogen, затем создайте вирусы для каждого конструкта, используя клетки HEK 2 93 FT. После определения титра проведите трансдукцию клеток вирусом и примените антибиотический отбор, затем расширьте популяцию полученных стабильных клеток, экспрессирующих GFP DRON или GFP Dron со сдвигом рамки считывания.

Данный метод позволяет проводить эксперименты по мониторингу клеточного ответа на определенные воздействия путем измерения флуоресцентного сигнала. Например, активность протеасом можно легко оценить с помощью эпифлуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии. Основное преимущество этого метода перед существующими способами, такими как люмино- или флуорогенные анализы с использованием полноклеточных кислот, заключается в том, что активность протеасом измеряется в живых клетках. Для трансфекции разведите 36 µL реагента Lipofectamine 2000 в 1,5 mL DMEM; в другой пробирке Falcon объемом 15 mL разведите ДНК-конструкции в 1,5 mL DMEM.

Через пять минут объедините два компонента и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем замените среду в конфлюэнтной культуре клеток HEK 2 93 FT в колбе T 75 на семь миллилитров DMEM. После этого добавьте в колбу смесь ДНК с липосомами и перемешайте, аккуратно покачивая колбу из стороны в сторону.

Инкубируйте колбу в течение ночи при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2. На следующий день замените среду на 10 мл DMEM. Через 48 часов соберите супернатант. Профильтруйте супернатант, содержащий вирус, через PVDF-фильтр с порами 0,45 мкм.

Для концентрирования вируса добавьте один объем раствора ПЭГ к четырем объемам супернатанта и инкубируйте в течение двух часов при температуре 4 °C, периодически перемешивая путем переворачивания пробирки. Соберите вирус путем центрифугирования, затем, после аспирации супернатанта с белого осадка, снова центрифугируйте образец, чтобы удалить остатки раствора ПЭГ. Ресуспендируйте итоговый осадок в PBS с помощью дозатора, затем интенсивно перемешайте на вортексе в течение 20–30 секунд.

Храните аликвоты вируса по 100 µL при -80 °C. Рассейте клетки U2 OS по шестилуночным планшетам и инкубируйте в течение ночи. Для трансфекции замените культуральную среду на 1 mL DMEM, содержащей 8 µg/mL Polybrain. Одну лунку оставьте в качестве положительного контроля, а в остальных лунках протестируйте серию концентраций вируса.

Инкубируйте в течение ночи на следующий день. Замените среду на 2 мл DMEM и инкубируйте в течение 24 часов. Начните селекцию с использованием бластикана в концентрации 10 µg/ml и продолжайте заменять среду, содержащую антибиотик, каждые два дня.

Примерно через шесть-семь дней подтвердите гибель нетрансдуцированных клеток. Затем трижды промойте клетки PBS для последующего окрашивания. Покройте клетки кристаллическим фиолетовым и инкубируйте от 5 до 10 минут при комнатной температуре, после чего удалите краситель, дважды промойте лунки дважды дистиллированной водой и высушите планшет на воздухе.

Наконец, подсчитайте количество колоний, чтобы рассчитать количество единиц трансфекции вируса на миллилитр. Посейте диплоидные фибробласты человека в 6-луночные планшеты, используя 8 мкг/мл Polybrene в качестве усилителя трансдукции.

Используйте кратность заражения, равную двум, в общем объеме одного миллилитра. Замените среду. На следующий день, когда культура достигнет 70–80% конфлюэнтности.

Начните хронический отбор с концентрацией 10 µg/mL. В течение нескольких дней контролируйте гибель клеток, что будет указывать на завершение процесса отбора. Нарастите популяцию стабильно трансдуцированных клеток для создания стабильной клеточной линии, экспрессирующей слитные белки GFP DERON или GFP Deron Frameshift. Начните с посева клеток, несущих либо GFP DRON, либо GFP DRON frameshift; на следующий день, за три часа до факса.

Обработайте контрольные клетки ингибитором протеасом. Дважды промойте их PBS и соберите клетки, используя 0.5 milliliters трипсина. Чтобы остановить действие трипсина.

Используйте 4,5 мл культурной среды и перенесите клетки в 15-мл пробирку Falcon. Соберите клетки путем центрифугирования. После одного промывания с помощью PBS ресуспендируйте осадок в 400 мкл буфера FACS. Перенесите клетки в пробирки для FACS и поместите на лед.

Теперь измерьте образцы с помощью проточной цитометрии. Слитый белок GFP Deron содержит последовательность, которая направляет его в протеасому для немедленной деградации. Напротив, мутант со сдвигом рамки считывания GFP Deron FS не подвергается деградации протеасомами.

Таким образом, при трансдукции GFP Deron молодые человеческие дермальные фибробласты с ожидаемо высокой протеасомной активностью демонстрируют слабый флуоресцентный сигнал при эпифлуоресцентной микроскопии. Те же клетки, трансдуцированные GFP Deron Frameshift, имеют 39,7% положительных клеток. Обработка клеток ингибиторами протеасом ll и L приводит к усилению сигналов до максимума примерно в 63% как в клетках с GFP Deron, так и в клетках с GFP Deron Frameshift.

Аналогичные измерения в дермальных фибробластах, выделенных из образцов молодых, лиц среднего возраста и пожилых доноров, выявляют отчетливое усиление сигнала GFP при сравнении молодых лиц и доноров среднего возраста, что указывает на снижение активности протеасом в образцах, полученных от пожилых доноров. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как производить лентивирусные частицы, проводить трансфекцию клеток и определять активность протеасом в живых клетках.