Построение и недорогие лазерные Axotomy система по изучению Axon Регенерация в С. Элеганс

Общая цель этой процедуры — показать, как собрать и выровнять систему лазерной абляции для изучения регенерации аксонов в CL gans. Это достигается путем установки на макетную плату лазерного сальника поляризатора Томпсона, полуволновой пластины, поворотного зеркала, перископической рейки и рельсового зеркала. Следующим этапом процедуры является выравнивание лазерного луча по исходящему лучу от линзы конденсора микроскопа.

Затем линза расширителя лазерного луча установлена, выровнена и расположена так, чтобы центрировать лазерный луч и сделать его нулевым расходящимся. Заключительным этапом процедуры является согласование пятна лазерной абляции с фокусом изображения путем выполнения тонких настроек. В конечном счете, можно точно вырезать полумикронные аксоны с минимальным повреждением тканей с помощью дифракционного ограниченного лазерного луча при неидеальном выравнивании XY NC.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как фемто-лазеры, заключается в том, что она относительно недорогая и составляет 15 000 рублей. Он относительно неприхотлив в обслуживании и обеспечивает очень точную резку аксонов. Хотя этот метод может дать представление о регенерации аксонов морского эльгана, он также может быть применен к другим системам, таким как мухи, мышь данио-рерио, периферическая нервная система и клетки in vitro.

По сути, любая клетка, которая находится в пределах от 30 до 50 микрометров от поверхности. Начните с компонентов, расположенных на макетной плате, и прикрутите болтами стойку лазерного перископа и приподнятые рельсовые опоры. В этой системе используется лазер класса три B, который может легко повредить ваши глаза, поэтому, пожалуйста, относитесь к безопасности лазера серьезно.

Поговорите с кем-нибудь из местного физического факультета о том, как безопасно работать со свободными лазерами. Всегда в процессе юстировки устанавливайте лазер на самую низкую мощность. Когда вы смотрите в окуляры, убедитесь, что лазер механически закрыт и лазер выключен

Теперь расположите микроскоп первым, выровняйте его по оси рельса. Во-вторых, совместите его с проходящим световым лучом от линзы конденсора микроскопа. В-третьих, совместите оба конца рельса с лучом конденсатора с помощью регулируемой апертуры или линзы, прикрепленной к рельсу.

Используйте уровень и лабораторные домкраты, чтобы отрегулировать высоту рельса, прежде чем продолжить. Убедитесь, что оба конца рельса выровнены. Теперь убедитесь, что лазерный луч проходит через сальник, поляризатор Томпсона и половинную пластину и не ударяется об их края при вращении.

Промежуточная пластина будет регулировать мощность лазера со всеми компонентами, закрепленными на макетной плате. Включите лазер, установите частоту импульсов на 100 непрерывный режим и уменьшите мощность до минимума с помощью половинной пластины. Используйте стикер или бумагу для линз, чтобы визуализировать лазерный луч.

Теперь подвести лазерный луч вверх от макетной платы. Отрегулируйте и зафиксируйте кинематически установленные зеркала последовательно от лазера, чтобы направить луч к зеркалу, установленному на конце приподнятой направляющей. По завершении лазерный луч должен быть выровнен примерно по центру зеркал, а зеркала должны быть ориентированы примерно на 45 градусов к оси лазерного луча, прежде чем совмещать лазерный луч с проходящим световым лучом микроскопа.

Снимите или откройте все нейтральные фильтры и апертуры в промежуточном модуле. Теперь мы приступаем к самому важному шагу, чтобы обеспечить точную резку аксонов без чрезмерного сопутствующего ущерба. Мы собираемся точно выровнять лазер по осям X, Y и Z при наименьшей мощности лазера, чтобы получить наименьшее пятно абляции.

Лазер и проходящие световые лучи можно одновременно видеть на бумаге. Для начала расположите бумагу рядом с портом микроскопа. Теперь начните юстировку лазера с помощью регулировки курса на зеркале в верхней части перископа и зеркале на конце рельса.

Поместите бумагу между выровненной линзой конденсора и открытой револьверной головкой объектива. Продолжайте использовать тонкие настройки на рельсовом зеркале, чтобы выровнять лазерный луч по центру большего проходящего светового луча. Теперь закрепите микроскоп на месте с помощью зажимов.

Дополнительные шаги по оценке юстировки лазера можно найти в письменной рукописи. Двойные расширители галилеевого луча должны быть установлены для расширения лазерного луча 300 микрон в 33 раза, чтобы заполнить заднюю апертуру 10-миллиметрового объектива. Начните с установки четырех линз на держатели.

Затем прикрепите линзы к рейке так, чтобы все они находились на одной оптической оси и точно ортогонально лазерному лучу. Включите лазер и настройте его на минимальную мощность и на непрерывный режим. Примерно отрегулируйте выравнивание луча через каждую линзу.

Используйте бумагу, чтобы увидеть луч. Теперь выключите лазер. Наденьте на лазер защитную шторку и уберите микроскоп с пути лазерного луча.

Снова включите лазер и визуализируйте его на фоне ближайшей стены. Используйте тонкую регулировку линз для расширения луча. Затем отрегулируйте два последних кинематически установленных зеркала, чтобы выровнять луч в круг равномерной яркости в предполагаемом положении задней апертуры объектива.

Просмотрите размер и равномерность луча на бумаге. Затем отрегулируйте сходимость луча до нуля, обратив внимание на то, как изменяется размер луча по мере удаления бумаги от объектива. Выключите лазер и включите механический затвор.

Сдвиньте микроскоп обратно на траекторию лазерного луча с помощью фиксированных зажимов, чтобы определить правильное выравнивание. Установите на место зажимы со свободной стороны микроскопа, но не затягивайте их. Теперь включите лазер.

Снимите защитную шторку и поверните револьверную головку объектива в открытое положение с помощью бумаги на сцене, и должен быть виден расширенный и равномерный лазерный луч, центрированный на проходящем световом луче от конденсора. Если пучки не отцентрированы, отцентрируйте их, ослабив зажимы микроскопа и осторожно подтолкнув микроскоп. Теперь зафиксируйте защитную шторку и переведите лазер в режим срабатывания.

Поверните объектив в 60 раз на место. Теперь изображение царапин поверхности на предметном стекле мишени. Снимите защитную шторку, запустите лазер абляции и отрегулируйте мощность лазера для достижения минимальной точки абляции.

Пятно должно быть круглым и находиться в пределах от пяти до 10 микрон от центра изображения, центра, пятна абляции. Используя точную регулировку кинематически установленного рельсового зеркала, чтобы сохранить пятно по центру и равномерный профиль луча, необходимо будет итеративно отрегулировать зеркало на рельсе и верхнее перископическое зеркало. Оцените Z-фокус лазера, систематически перемещая фокус вверх и вниз с шагом в один микрон, запускайте абляционный лазер на каждом шаге.

Если луч правильно расширен и выровнен и с правильно отрегулированной сходимостью, то он должен максимально абляться в фокусе изображения и слабее или вообще не удаляться, на один микрон выше или ниже фокуса. Если максимальное пятно абляции находится выше или ниже фокуса изображения, то внесите окончательные корректировки Z-фокуса расширенного луча, перемещая линзу L 3 галилеева телескопа до тех пор, пока лазерная абляция не станет конгруэнтной с фокусом изображения. Нематоды были прикреплены к специальному предметному стеклу, а аксоны были удалены с помощью сконструированной системы Laser exo somy и покадровая визуализация регенерации аксонов была очень надежной.

Используя моторизованный стол, можно было регулярно и точно вырезать и визуализировать пять аксонов у пяти разных животных. На одном слайде. Ограничивающим фактором было время визуализации аксонов.

Около 10% экспериментов позволили получить высококачественные цейтраферные фильмы. Все остальные эксперименты предоставили хорошие данные, но были эстетически менее привлекательными из-за небольших дрожащих движений червя, которые обычно начинались после пяти-восьми часов иммобилизации. При попытке выполнить эту процедуру всегда важно точно оценить выравнивание лазера по осям X, Y и Z.

Наиболее распространенной проблемой, с которой сталкиваются люди, пытающиеся разрезать аксоны, являются сопутствующие повреждения или полная невозможность разрезать аксоны, и это почти всегда происходит из-за смещения лазера. Эта система лазерной абляции и техника визуализации регенерации аксонов в c Agains позволят вам регулярно анализировать влияние любой генетической мутации на регенерацию аксонов. NCL Agains.