Построение и недорогие лазерные Axotomy система по изучению Axon Регенерация в С. Элеганс

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать способ сборки и юстировки системы лазерной абляции для изучения регенерации аксонов в ганглиях заднего корешка (CL gans). Для этого сначала на оптическом столе монтируются лазерный вывод, поляризатор Томпсона, полуволновая пластинка, поворотное зеркало, перископ, направляющая и зеркало на направляющей. Следующим этапом процедуры является совмещение лазерного луча с выходящим лучом из конденсорного объектива микроскопа.

Затем устанавливают, юстируют и позиционируют линзу расширителя лазерного луча, чтобы центрировать луч и сделать его с нулевой расходимостью. Заключительным этапом процедуры является совмещение пятна лазерной абляции с фокусом изображения путем точной настройки. В конечном итоге, используя дифракционно-ограниченный лазерный луч, можно точно пересечь аксоны толщиной в полмикрона с минимальным сопутствующим повреждением тканей даже при несовершенном выравнивании по осям XY NC.

Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как использование фемтосекундных лазеров, является его относительная дешевизна (15 000). Он практически не требует технического обслуживания и обеспечивает очень точное перерезание аксонов. Хотя этот метод позволяет изучить регенерацию аксонов у C. elegans, он также может быть применен к другим системам, таким как мухи, данио-рерио, мыши, периферическая нервная система, а также к клеточным культурам in vitro.

По сути, любая клетка, находящаяся на расстоянии от 30 до 50 micrometers от поверхности. Начните с размещения компонентов на оптическом столе, затем закрепите болтами стойку лазерного перископа и приподнятые направляющие опоры. В данной системе используется лазер класса 3B, который может легко повредить ваши глаза, поэтому, пожалуйста, серьезно относитесь к соблюдению техники безопасности при работе с лазером.

Проконсультируйтесь с сотрудниками вашего физического факультета о правилах безопасной работы с лазерами с открытым лучом. Во время процесса юстировки всегда устанавливайте минимальную мощность лазера. При просмотре через окуляры убедитесь, что лазер закрыт механической заслонкой и выключен.

Теперь установите микроскоп следующим образом: во-первых, совместите его с осью направляющей. Во-вторых, совместите его с пучком проходящего света от конденсора микроскопа. В-третьих, совместите оба конца направляющей с лучом конденсора, используя регулируемую диафрагму или линзу, закрепленную на направляющей.

Перед продолжением используйте уровень и лабораторные домкраты для регулировки высоты направляющей. Убедитесь, что оба конца направляющей выровнены. Теперь убедитесь, что лазерный луч проходит через зажим, поляризатор Томпсона и полуволновую пластинку и не задевает их края при вращении.

С помощью полупрозрачной пластинки можно отрегулировать мощность лазера при условии, что все компоненты закреплены на оптическом столе. Включите лазер, установите частоту импульсов на 100 в непрерывном режиме и с помощью полупрозрачной пластинки снизьте мощность до минимума. Для визуализации лазерного луча используйте стикер или салфетку для линз.

Теперь необходимо направить лазерный луч с оптической плиты вверх. Последовательно отрегулируйте и закрепите кинематические крепления зеркал, начиная от лазера, чтобы направить луч на зеркало, установленное на конце приподнятой направляющей. По завершении лазерный луч должен быть примерно центрирован относительно зеркал, а сами зеркала должны быть ориентированы под углом примерно 45 градусов к оси луча лазера перед тем, как приступать к совмещению лазерного луча с лучом прошедшего света микроскопа.

Снимите или откройте любые ND-фильтры и диафрагмы в промежуточном модуле. Теперь мы переходим к самому критическому этапу, чтобы обеспечить точный разрез аксонов без избыточного сопутствующего повреждения. Мы точно выровняем лазер по осям x, y и z при минимальной мощности лазера, чтобы получить минимальный размер пятна абляции.

Лазерный и прошедший пучки света могут быть видны одновременно на фоне бумаги. Для начала расположите лист бумаги рядом с портом микроскопа. Теперь приступите к юстировке лазера, используя грубые регулировки зеркала в верхней части перископа и зеркала на конце направляющей.

Поместите лист бумаги между выровненной линзой конденсора и открытой револьверной головкой объективов. Продолжайте использовать винты точной настройки на зеркале направляющей, чтобы совместить лазерный луч с центром более широкого пучка проходящего света. Теперь зафиксируйте микроскоп с помощью зажимов.

Дополнительные шаги по оценке юстировки лазера приведены в письменной рукописи. Для расширения лазерного луча диаметром 300 мкм в 33 раза с целью заполнения задней апертуры 10-миллиметрового объектива необходимо установить два галилеевских расширителя пучка. Начните с установки четырех линз в держатели.

Затем закрепите линзы на направляющей таким образом, чтобы все они находились на одной оптической оси и были строго перпендикулярны лазерному лучу. Включите лазер, установите минимальную мощность и непрерывный режим работы. Грубо отрегулируйте юстировку луча, проходящего через каждую линзу.

Используйте бумагу, чтобы увидеть луч. Теперь выключите лазер. Установите защитную заслонку на лазер и уберите микроскоп с пути лазерного луча.

Снова включите лазер и визуализируйте луч на ближайшей стене. Используйте точную настройку линз, чтобы расширить пучок. Затем отрегулируйте два последних кинематически закрепленных зеркала, чтобы направить луч так, чтобы в предполагаемом положении задней апертуры объектива образовался круг равномерной яркости.

Оцените размер и однородность луча на бумаге. Затем отрегулируйте луч до нулевой конвергенции, наблюдая за изменением размера луча при перемещении бумаги дальше от линзы. Выключите лазер и закройте механический затвор.

Сдвиньте микроскоп обратно на путь лазерного луча, используя фиксирующие зажимы для обеспечения правильного совмещения. Установите зажимы на свободной стороне микроскопа, но не затягивайте их. Теперь включите лазер.

Уберите защитную шторку и поверните револьвер объективов в открытое положение, используя бумагу на предметном столике; при этом должен быть виден расширенный и однородный лазерный луч, центрированный относительно луча transmitted light от конденсатора. Если лучи не центрированы, произведите центровку, ослабив зажимы микроскопа и аккуратно сдвинув его. Теперь закройте защитную шторку и переведите лазер в режим триггера.

Поверните объектив с увеличением 60x на месте. Теперь получите изображение поверхностных царапин на предметном стекле-мишени. Уберите защитную шторку, активируйте абляционный лазер и отрегулируйте мощность лазера для получения минимального пятна абляции.

Пятно должно быть круглым и находиться в пределах от 5 до 10 микрон от центра изображения, в центре будет находиться область абляции. Используя точную регулировку кинематически закрепленного рельсового зеркала для центрирования пятна и обеспечения однородности профиля луча, потребуется итерационная настройка рельсового зеркала и зеркала верхнего перископа. Оцените фокус Z лазера, систематически перемещая точку фокусировки вверх и вниз с шагом в 1 микрон, активируя абляционный лазер на каждом шаге.

Если луч правильно расширен, выровнен и имеет верно настроенную конвергенцию, то максимальная абляция должна происходить в фокусе изображения, а выше или ниже фокуса на один микрон абляция должна быть слабой или отсутствовать. Если точка максимальной абляции находится выше или ниже фокуса изображения, выполните окончательную настройку Z-фокуса расширенного луча, перемещая линзу L3 Галилеевского телескопа до тех пор, пока лазерная абляция не совпадет с фокусом изображения. Нематоды были закреплены на специально изготовленном предметном стекле, а аксоны аблировали с помощью сконструированной системы Laser exo somy; при этом таймлапс-визуализация регенерации аксонов была весьма стабильной.

С помощью моторизованного предметного столика удалось рутинно и точно разрезать и визуализировать пять аксонов от пяти разных животных на одном предметном стекле. Ограничивающим фактором стало время визуализации аксонов.

Примерно в 10% экспериментов были получены высококачественные таймлапс-видео. Остальные эксперименты также предоставили хорошие данные, но были менее эстетически привлекательными из-за небольших дрожащих движений червя, которые обычно начинались после пяти-восьми часов иммобилизации. При выполнении данной процедуры крайне важно точно оценивать юстировку лазера по осям x, y и Z.

Наиболее распространенной проблемой при попытке перерезать аксон являются сопутствующие повреждения или полная невозможность пересечь аксон, что почти всегда вызвано неправильной юстировкой лазера. Данная система лазерной абляции и метод визуализации регенерации аксонов в c Agains позволят вам регулярно оценивать влияние любой генетической мутации на регенерацию аксонов. NCL Agains.