Патч-зажим измерения емкости и Са ^{2 +} Изображений на Одноместный нервных окончаний в сетчатке глаза Ломтики

Общая цель этой процедуры заключается в подготовке встроенных в агар срезов сетчатки для исследования микросхем, расположенных в нервных окончаниях пресинаптических биполярных клеток. Это достигается путем получения сетчатки из темного приспособленного глаза золотой рыбки и вырезания небольшого прямоугольного кусочка этой сетчатки. Затем кусочек сетчатки погружают в прозрачный агаровый раствор с низкой температурой плавления, который затем затвердевает в красивом холодном растворе для срезов.

Следующим шагом является разрезание твердого агарового блока, содержащего прямоугольный кусочек сетчатки, с помощью вибратора. Последний шаг — визуализация, идентификация и исправление. Зажмите нервное окончание биполярной клетки.

В конечном счете, результаты показывают пресинаптический кальциевый ток и синаптический физический экзоцитоз с измерениями емкости мембраны из атомизированных и интактных биполярных клеточных терминалей. Здравствуйте, меня зовут Хан Ким. Я являюсь постдоком в лаборатории PCO в Институте Берхама.

Сегодня я собираюсь представить встраиваемый AGA срез препарата холодной лицевой сетчатки и продемонстрировать измерение емкости зажима пластыря на одном конвейере. Чтобы начать эту процедуру, подчешите каждый глаз золотой рыбки, равномерно разрезав вокруг передней части глаза пружинными ножницами. Затем поместите наглазники в охлажденный раствор для срезов без кальция.

При необходимости снимите линзу пинцетом. Затем удалите пигментный эпителий, прикрепленный к сетчатке, отшелушивая сетчатку от наглазника с помощью пары тонких щипцов под углом 45 градусов. После этого перережьте зрительный нерв либо тонкими щипцами, либо пружинными ножницами.

Затем примените отсасывание с помощью модифицированной пипетки для пасты или переносной пипетки с большим наконечником. Чтобы удалить сетчатку, аккуратно удалите остатки пигментного эпителия, прикрепленного к сетчатке. Поверхность очищенной и здоровой сетчатки должна казаться гладкой.

Затем обработайте изолированную сетчатку примерно на 0,03% выше IDE в течение 15-30 минут при комнатной температуре. Чтобы удалить стекловидное тело, учтите, что процедуру следует проводить при слабом освещении. На следующем этапе вырежьте прямоугольный кусок сетчатки размером примерно два на два миллиметра, который содержит всю толщину сетчатки, удалив изогнутые края лезвием бритвы.

Затем перенесите кусочек сетчатки в небольшую емкость, наполненную раствором агара, и постарайтесь свести к минимуму количество раствора вокруг сетчатки при его помещении в жидкий агар. Затем погрузите сетчатку с агаром непосредственно в ледяной раствор для срезов, чтобы агар затвердел. Затем разрежьте цельный блок агара, содержащий прямоугольный кусочек сетчатки, на кубик один на один сантиметр.

Приклейте блок к поверхности пластины для нарезки в камере предварительного нарезки. Затем нарежьте блок ломтиками толщиной от 200 до 250 микрон в ледяном растворе для ломтиков. Используя вибрато, можно получить в общей сложности от пяти до 10 ломтиков, которые сохраняют жизнеспособность в течение примерно пяти-шести часов.

После этого переложите один из срезов в камеру записи. Сверху на срез поместите U-образную платиновую рамку с сеткой из капроновых нитей. Непрерывно перфузируйте срез со скоростью один-два миллилитра в минуту раствором для записи, пузырчатым с карбогеном.

На этом этапе с помощью шприца с фильтрующим наконечником 0,2 микрона заполните стеклянную патч-пипетку внутренним раствором до уровня в одном-двух сантиметрах от тыльной стороны пипетки. Затем удалите пузырьки воздуха с кончика. Закрепите пипетку в держателе.

Надавите на пипетку и переместите ее к целевому терминалу с помощью микроманипулятора, перемещая наконечник вниз по срезу. Перемещайте пипетку в боковом направлении, чтобы срез не тянулся вместе с наконечником. Затем переместите наконечник пипетки вокруг клеммы, чтобы очистить поверхность мембраны.

Прижмите наконечник вниз к краю клеммы, чтобы создать углубление и ослабить положительное давление. Если гигаомное уплотнение не сформировано, немедленно надавите на пипетку с небольшим отрицательным сопротивлением. После того, как будет сформировано гигаомное уплотнение, переключите усилитель E PC с девятью патч-зажимами в режим записи onsell и измените удерживающий потенциал до минус 60 или минус 70 милливольт.

Примените быструю коррекцию емкости и подождите, пока уплотнение стабилизируется в диапазоне от пяти до 10 гигаом. Затем разорвите мембрану с помощью резкого, мягкого всасывания. Установить конфигурацию записи всей ячейки.

Вы также можете использовать отсасывание через рот вместо шприца. После того, как вся конфигурация ячейки установлена на распыленном клемме MB, примените 200-миллисекундный шаг деполяризации от минус 70 до нуля милливольт. Помните, что синусоида в два килогерца в режиме зажима напряжения применяется до и после этой деполяризации.

Параллельно можно контролировать скачок емкости, вызванный кальций-зависимым экзоцитозом синаптических везикул, который увеличивает площадь поверхности мембраны. Если интактная биполярная клетка MB будет подключена к пипетке на синаптической окончании, то различимые кальциевые токи не будут наблюдаться из-за больших токов утечки из-за связи между щелевыми соединениями в правах на биполярные клетки MB. То, что мы наблюдаем, является большой утечкой наружу, похожей на ток.

Тем не менее, все еще можно контролировать скачок емкости с помощью высокочастотного синусоидального стимула, активированного до и после показанного шага деполяризации. Вот примеры I-R-D-I-C, изображения биполярных клеточных терминалей M. Неповрежденные терминалы с большей вероятностью будут казаться эллиптическими, как показано на рисунках A и B, в то время как C показывает мизированную клемму, которая выглядит круглой и круглой.

Метод заполнения красителем также может быть использован для классификации клеточных клемм. Вот примеры флуоресцентных изображений биполярных клеточных терминалей MBI с интактным аксоном в D, частично отрезанным аксоном в e и полностью удаленным аксоном в F. Их терии обозначены синими стрелками. Здесь показаны прямые измерения сигналов визуализации кальция, экзоцитоза и ингибиторной обратной связи.

В клемме биполярной клетки MB преходящее повышение концентрации кальция в телерии терминала MB было активировано путем деполяризации шага зажима напряжения в соответствующем флуоресцентном изображении телерии MB можно увидеть в В. Примеры кратковременного синаптического угнетения высвобождения нейротрансмиттеров показаны в С. При попытке выполнить эту процедуру, Важно помнить о минимизации количества раствора вокруг сетчатки при его помещении в набор агара. Это улучшит прикрепление латинизированных из агарового блока.