Патч-зажим измерения емкости и Са ^{2 +} Изображений на Одноместный нервных окончаний в сетчатке глаза Ломтики

Общая цель данной процедуры заключается в подготовке срезов сетчатки, встроенных в агар, для изучения микроцепей, расположенных в пресинаптических нервных терминалях биполярных клеток. Это достигается путем извлечения сетчатки из глаза золотой рыбки, адаптированного к темноте, и вырезания небольшого прямоугольного фрагмента этой сетчатки. Затем фрагмент сетчатки погружают в прозрачный раствор агара с низкой температурой плавления, который затем подвергают затвердеванию в охлажденном растворе для срезов.

Следующим этапом является нарезание с помощью вибротома твердого блока агара, содержащего прямоугольный фрагмент сетчатки. Заключительный этап заключается в визуализации, идентификации и патч-клампинге терминали нерва биполярной клетки.

В конечном итоге результаты демонстрируют пресинаптический кальциевый ток и физический синаптический экзоцитоз по данным измерений емкости мембраны атомизированных и неповрежденных терминалей биполярных клеток. Здравствуйте, меня зовут Хан Ким. Я постдок в лаборатории PCO в Институте Берхэма.

Сегодня я представлю метод подготовки эксплантатов сетчатки передней части глаза золотой рыбки с использованием метода AGA и продемонстрирую измерение емкости методом патч-клампа в едином контуре. Для начала данной процедуры проведите гемисекцию каждого глаза золотой рыбки, равномерно срезая переднюю часть глаза пружинными ножницами. Затем поместите чашечки глаз в охлажденный раствор для срезов, не содержащий кальция.

При необходимости удалите хрусталик с помощью пинцета. Затем удалите пигментный эпителий, прикрепленный к сетчатке, отделяя сетчатку от глазной чаши с помощью тонкого пинцета с загнутыми под углом 45 градусов кончиками. После этого перережьте зрительный нерв тонким пинцетом или пружинными ножницами.

Затем удалите жидкость с помощью модифицированной паста-пипетки или большой наконечной пипетки для переноса. Чтобы извлечь сетчатку, осторожно удалите остатки прикрепленного к ней пигментного эпителия. Поверхность очищенной здоровой сетчатки должна быть гладкой.

Затем обработайте изолированную сетчатку раствором IDE с концентрацией примерно 0,03% в течение 15–30 минут при комнатной температуре. Обратите внимание, что процедура удаления стекловидного тела должна проводиться при слабом освещении. На следующем этапе с помощью лезвия бритвы удалите изогнутые края и вырежьте прямоугольный фрагмент сетчатки размером примерно два на два миллиметра, включающий всю толщину сетчатки.

Затем перенесите фрагмент сетчатки в небольшой контейнер, заполненный раствором агара, стараясь свести к минимуму количество раствора вокруг сетчатки при ее помещении в жидкий агар. После этого погрузите сетчатку вместе с агаром непосредственно в ледяной раствор для срезов, чтобы агар затвердел. Затем вырежьте из затвердевшего блока агара, содержащего прямоугольный фрагмент сетчатки, куб размером один на один на один сантиметр.

Приклейте блок к поверхности режущей пластины в камере для нарезки срезов preco. Затем нарежьте блок на срезы толщиной от 200 до 250 микрон в ледяном растворе для нарезки. С помощью вибратома можно получить в общей сложности от пяти до 10 срезов, которые остаются жизнеспособными в течение примерно пяти-шести часов.

После этого перенесите один из срезов в регистрирующую камеру. Поместите U-образную платиновую рамку с сеткой из нейлоновых нитей поверх среза. Обеспечьте непрерывную перфузию среза регистрирующим раствором, насыщенным карбогеном, со скоростью от 1 до 2 мл/мин.

На данном этапе с помощью шприца с фильтром 0,2 мкм заполните стеклянную патч-пипетку внутренним раствором до уровня одного-двух сантиметров от заднего конца пипетки. Затем удалите пузырьки воздуха из кончика. Закрепите пипетку в держателе.

Создайте положительное давление в пипетке и с помощью микроманипулятора переместите ее к целевому терминалу, продвигая кончик вниз сквозь срез. Перемещайте пипетку боковыми sweeping-движениями, чтобы срез не смещался вслед за кончиком. Затем обведите кончиком пипетки вокруг терминала, чтобы очистить поверхность мембраны.

Надавите наконечником вниз на край терминала, чтобы создать углубление, и сбросьте положительное давление. Если гигаомный затвор не сформировался сразу, приложите к пипетке небольшое отрицательное давление. После формирования гигаомного затвора переключите усилитель patch-clamp E PC nine в режим записи on-cell и установите поддерживающий потенциал на -60 или -70 millivolts.

Примените быструю коррекцию емкости и дождитесь стабилизации сопротивления плотного контакта в диапазоне от 5 до 10 ГОм. Затем аккуратно и резко примените отрицательное давление (всасывание) для прорыва мембраны, чтобы установить конфигурацию записи из всей клетки.

Вместо шприца можно также использовать ротовое всасывание. После того как конфигурация «целая клетка» будет установлена на атомизированном терминале MB, приложите ступенчатую деполяризацию длительностью 200 миллисекунд от минус 70 до нуля милливольт. Помните, что до и после этой деполяризации в режиме фиксации потенциала подается синусоида с частотой два килогерца. Для измерения емкости мембраны деполяризация позволяет напрямую измерить входящие кальциевые токи, активируемые открытием потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа, при использовании внутреннего раствора на основе цезия.

Параллельно можно отслеживать скачок емкости, вызванный кальций-зависимым экзоцитозом синаптических везикул, который увеличивает площадь поверхности мембраны. Если в интактную биполярную клетку MB установить патч-зажим с помощью пипетки на синаптическом окончании, заметных кальциевых токов наблюдаться не будет из-за больших токов утечки, обусловленных сопряжением через щелевые контакты в области биполярных клеток MB. Вместо этого наблюдается большой выходящий ток, напоминающий ток утечки.

Тем не менее, все еще можно отслеживать скачок емкости с помощью высокочастотного синусоидального стимула, активируемого до и после показанного деполяризующего шага. Ниже приведены примеры I-R-D-I-C, изображения терминалей M-биполярных клеток. Неповрежденные терминали с большей вероятностью будут иметь эллиптическую форму, как показано на A и B, в то время как на C изображен поврежденный терминал, который выглядит круглым и сферическим.

Метод заполнения красителем также может быть использован для классификации терминалей клеток. Здесь представлены примеры флуоресцентных изображений терминалей биполярных клеток MBI с сохранным аксоном на рис. D, частично перерезанным аксоном на рис. e и полностью удаленным аксоном на рис. F. Их терминали отмечены синими стрелками. Далее приведены результаты прямых измерений сигналов кальциевого имиджинга экзоцитоза и тормозной обратной связи.

В терминале биполярной клетки MB кратковременное повышение концентрации кальция в телерии терминала MB было вызвано ступенчатой деполяризацией при методе фиксации потенциала; соответствующее флуоресцентное изображение телерий MB представлено на рисунке B. Примеры краткосрочной синаптической депрессии высвобождения нейромедиатора показаны на рисунке C. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости минимизировать количество раствора вокруг сетчатки при ее помещении в агар набора. Это улучшит прикрепление латинизированных структур к блоку агара.