Органотипической культур Кусочек Эмбриональные Брюшной мозга: системы по изучению дофаминергической нейронов развития В пробирке

Общая цель данной процедуры заключается в получении органотипических срезов эмбрионального среднего мозга на стадии E 12.5 для анализа развивающихся дофаминергических нейронов. Для этого сначала проводят диссекцию эмбрионального мозга, после чего мозг заключают в низкоплавкий агар.

Третьим этапом является получение срезов мозга с использованием вибротома. Заключительный этап заключается в выборе подходящего среза мозга для культивирования и таймлапс-визуализации. В конечном итоге таймлапс-визуализация и иммунофлуоресцентная микроскопия используются для демонстрации ранних стадий развития дофаминергических нейронов, их миграционного поведения и дифференцировки.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроразвития, такие как отслеживание нейронов и их миграционного поведения в ходе развития вентральной части мозга. За один день до диссекции приготовьте 10X буфер Кребса, а за два часа до процедуры — культуральную среду согласно прилагаемой рукописи. Приготовьте 100 мл 4% низкоплавящегося агароза в буфере Кребса, нагревая раствор в микроволновой печи до полного растворения агароза.

Затем поместите арос в водяную баню при температуре 45 °C. После этого наполните лоток Vibram ледяным буфером Кребса. Включите охлаждающий элемент и поддерживайте температуру на уровне 4 °C.

После этого закрепите лезвие бритвы в держателе. Подготовьте скальпель, тонкую кисть и миниатюрную перфорированную ложечку для извлечения срезов из области вибратора для последующего секционирования. Затем добавьте буфер Кребса в стерильные чашки Петри и держите их на льду.

В зоне диссекции подготовьте три большие стерильные чашки Петри для проведения расчленения и две маленькие стерильные чашки Петри для заливки, пару маленьких ножниц, два пинцета с тонкими концами, мини-перфорированную ложку, огнеполированную стеклянную пастернаускую пипетку с закругленным закрытым концом и один литр буфера Кребса на льду. Протрите все инструменты для диссекции 70% этанолом. Затем добавьте культуральную среду в лунки планшета на шесть лунок и инкубируйте при 37 °C в течение двух часов.

Затем в стерильных условиях добавьте по 1,5 мл буфера Кребса с пенициллином и стрептомицином в каждую лунку другой шестьлуночной пластины. Поместите в лунки мембранные вставки Milli-Cell. Расположите шестьлуночную пластину рядом с вибратомом, чтобы срезы мозга можно было перенести на фильтрующие мембраны.

Сразу после проведения сечения проведите эвтаназию беременной самки мыши с эмбрионами на стадии E 12.5 и извлеките матку, приподняв ее пинцетом. Затем с помощью другого пинцета отделите миометрий от матки. После этого поместите матку в ледяной буфер Кребса под микроскопом.

С помощью тонкого пинцета отделите мышечную стенку матки, мембрану Рикера и висцеральный желточный мешок от эмбриона. Затем извлеките эмбрионы из матки и перенесите их в отдельную чашку Петри со стерильным буфером Кребса. После этого отсеките голову у каждого эмбриона.

Зафиксируйте голову, проколов ее на уровне глаз тонким пинцетом. С помощью другого пинцета осторожно удалите кожу и кости черепа. Затем аккуратно поднимите мозг и перенесите его в чашку Петри со стерильным буфером Кребса.

После этого промойте мозг в 4% низкоплавком агарозе. Залейте по два-три образца мозга в 4% свежую низкоплавкую агарозу, используя пастуровскую пипетку с оплавленным круглым кончиком.

Затем поместите чашки для встраивания на лед, стараясь распределить их максимально равномерно. После этого приподнимите мозг, пока дно арос-блока не затвердеет, чтобы мозг мог равномерно осесть и расположиться параллельно дну блока. Когда арос полностью затвердеет, обрежьте его вокруг мозга.

После этого приклейте блок с образцом к предметному столику вибратома. При приклеивании блока убедитесь, что вентральная сторона мозга расположена параллельно платформе. Выполните горизонтальные срезы толщиной 300 micron при частоте 50 hertz, амплитуде ножа 1.1 millimeters и скорости 25 millimeters per second.

Соберите срезы мозга, используя тонкую кисть, чтобы переместить срез в миниатюрную перфорированную ложку. Затем под микроскопом перенесите их в чашку со стерильным ледяным буфером Кребса. Выберите срез, содержащий ткань вентральной части среднего мозга.

На этом этапе с помощью мини-перфорированной ложечки и тонкой кисти перенесите срезы мозга на мембранные вставки milli в шестилуночном планшете с заранее приготовленным буфером Кребса. Затем перенесите мембраны со срезами в другой шестилуночный планшет с культуральной средой; следите за тем, чтобы верхняя часть мембран оставалась сухой, чтобы срезы мозга получали питательную среду снизу и воздух сверху.

Поместите срезы в инкубатор с 5% carbon dioxide при 37 °C. Очень важно поместить срезы в инкубатор в течение двух часов после начального этапа диссекции. Эти срезы могут поддерживаться in vitro от трех до четырех дней.

После четырех-пяти часов восстановления срезы можно использовать для таймлапс-визуализации непосредственно перед началом съемки. Добавьте в чашку 1.5 µL 200 mM аскорбиновой кислоты, чтобы защитить срезы от фототоксичности.

Инкубируйте срезы в климатической камере при 37 °C с 5% carbon dioxide во время таймлапс-визуализации. Перед вами острый срез, демонстрирующий нормальное расположение дофаминергических нейронов в вентральной части среднего мозга, в котором проекции к переднему мозгу еще не развились. Через один день культивирования начинают формироваться проекции к переднему мозгу, на что указывает желтая стрелка.

Белые наконечники стрелок указывают на расположение тел клеток, показанных с большим увеличением на врезках. Здесь представлен путь миграции нейронов, меченных YFP. На остром горизонтальном срезе исходное положение клеток отмечено красным наконечником стрелки.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как подготавливать генотипированные срезы среднего мозга эмбриона морской свинки на стадии E 12.5 для получения жизнеспособных и целостных срезов. Важно тщательно проводить диссекцию эмбрионального мозга, а после секционирования на вибратоме правильно выбирать срез мозга для культивирования и TimeLapse-визуализации.