Органотипической культур Кусочек Эмбриональные Брюшной мозга: системы по изучению дофаминергической нейронов развития В пробирке

Общая цель этой процедуры заключается в создании органотипических срезов из эмбрионального среднего мозга E 12.5 нейрона для анализа развивающихся дофаминергических нейронов. Это достигается путем препарирования мозга эмбриона. Затем мозг встраивается в низкоплавящие аэрозы.

Третий шаг — разрезание срезов мозга с помощью вибратора. Последний шаг — выбрать правильный срез мозга для культивирования и покадровой визуализации. В конечном счете, покадровая визуализация и иммунофлуоресцентная микроскопия используются для того, чтобы показать ранние этапы развития дофаминергических нейронов, миграционное поведение и дифференцировку.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроразвития, такие как следование за нейронами и миграционное поведение во время развития вентрального мозга. Примерно за два часа до вскрытия приготовьте один буфер Х-Кребса и питательную среду в соответствии с прилагаемой рукописью. Приготовьте 100 миллилитров 4%-ного низкоплавкого ароса в буфере Кребса, разогрев раствор в микроволновой печи до полного растворения ароса.

Затем поместите арос на водяную баню с температурой 45 градусов Цельсия. Затем заполните буферный лоток Vibram ледяным буфером Кребса. Включите охлаждающий элемент и держите его на отметке четыре градуса Цельсия.

После этого закрепите лезвие бритвы в держателе лезвия. Подготовьте скальпель, тонкую кисть и мини-перфорированную ложку для сбора срезов в области вибратора для последующего разрезания. Затем добавьте буфер Кребса в стерильные чашки Петри и держите их на льду.

В зоне вскрытия подготовьте три большие стерильные чашки Петри для вскрытия и две маленькие стерильные чашки Петри для вставки пары маленьких ножниц, две пары тонких щипцов, мини-перфорированную ложку, стеклянную пастбищную пипетку, отполированную с круглым закрытым наконечником, и один литр буфера Кребса на льду. Протрите все инструменты для вскрытия 70% этанолом. Затем добавьте питательную среду в лунки шестилуночного планшета и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов.

Далее добавьте по 1,5 миллилитров буфера Кребса с пенициллином-стрептомицином в каждую лунку еще одной шестилуночной пластины в стерильных условиях. Поместите в лунки вставки из милликлеточной мембраны. Поместите шестилуночную пластину рядом с вибрато, чтобы срезы мозга могли быть перенесены на фильтрующие мембраны.

Сразу после секции принесите в жертву беременную самку мыши с эмбрионами на стадии Е 12,5 и удалите матку, подняв ее вверх с помощью пары щипцов. Затем с помощью другой пары щипцов оторвите миометрий от матки. После этого поместите матку в ледяной буфер Кребса под микроскопом.

С помощью пары тонких щипцов отделите мышечную стенку матки, мембрану Рикера и мешок с висцеральным желтком от эмбриона. Затем извлеките эмбрионы из матки и переместите эмбрион в отдельную чашку Петри со стерильным буфером Кребса. Далее отрежьте по головке у каждого из эмбрионов.

Зафиксируйте голову, проколов ее через нее на уровне глаз парой тонких щипцов. С помощью другой пары щипцов аккуратно удалите кожу и череп. Затем осторожно поднимите мозг вверх и перенесите его в чашку Петри со стерильным буфером Кребса.

После этого промойте мозги до 4% низкой температуры плавления арос. Встраивайте два-три мозга за раз в 4%-ный свежий арос с низкой температурой плавления. С помощью пастеровской пипетки с отполированным огнем круглым кончиком.

Затем поместите закладные формы на лед как можно ровнее. Затем поднимите мозги до тех пор, пока дно ароса не затвердеет, чтобы мозги могли равномерно располагаться и быть параллельными дну блока арос. Когда арос полностью застынет, обрежьте арос, окружающий мозг.

После этого клея арос блокируется на ступени образца вибратора. При склеивании блока следите за тем, чтобы вентральная сторона мозга была параллельна платформе. Секция толщиной 300 микрон горизонтальными срезами с частотой 50 герц, амплитудой лезвия 1,1 миллиметра и скоростью 25 миллиметров в секунду.

Соберите ломтики мозга, используя тонкую кисть, чтобы надавить на ломтик на мини-перфорированную ложку. Затем переложите их в чашку со стерильным ледяным буфером Кребса под микроскопом. Выберите срез, который содержит вентральную ткань среднего мозга.

На этом этапе используйте мини-перфорированную ложку и тонкую кисть, чтобы перенести срезы мозга на вставки милликлеточной мембраны в шестилуночной пластине с буфером Кребса, который был приготовлен ранее. Далее переложите мембраны с ломтиками еще на шесть. Хорошо наложите тарелку с питательной средой, следите за тем, чтобы верхние части мембран были сухими, чтобы на срезы мозга попала среда снизу и воздух сверху.

Поместите дольки в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Очень важно, чтобы срезы были помещены в инкубатор в течение двух часов после начального этапа вскрытия. Эти срезы могут сохраняться in vitro в течение трех-четырех дней.

После четырех-пяти часов восстановления. Срезы можно использовать для цейтраферной съемки непосредственно перед визуализацией. Добавьте в блюдо 1,5 микролитра, 200 миллимоляров аскорбиновой кислоты, чтобы защитить ломтики от фототоксичности.

Инкубируйте срезы в климатической камере при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом во время покадровой визуализации. Вот острый срез, показывающий нормальное расположение дофаминергических нейронов в вентральном среднем мозге, в котором проекции на передний мозг еще не развились. После одного дня в культуре начинают формироваться проекции на передний мозг, на что указывает желтая стрелка.

Белая стрелка указывает на расположение тел клеток, показанных в большем увеличении во вставках. Вот миграционный корень меченых YFP нейронов. На остром горизонтальном срезе начальное положение клеток отмечается красной стрелкой.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как готовить генотипические срезы из морского эмбрионального среднего мозга E 12.5 для получения жизнеспособных и неповрежденных срезов. Важно тщательно провести вскрытие эмбрионального мозга и после секции вибрато выбрать правильный срез мозга для культивирования и визуализации TimeLapse.