После Cell-судьба

Общая цель данной процедуры заключается в использовании флуоресцентного микроскопа для отслеживания сульфата в e coli в режиме реального времени после инфицирования фагом lambda. Начните с приготовления грубого лизата фага lambda. Затем очистите фаг и проведите инфицирование e coli фагом lambda в пробирке.

Продолжайте наблюдение за судьбой бактериальных клеток под микроскопом. В конечном итоге этот метод позволяет в режиме реального времени отслеживать различные варианты развития событий для клеток E. coli посредством экспрессии различных флуоресцентных белков, связанных с ростом или гибелью клеток. Как правило, одним из этапов проверки данного метода является создание очищенного и меченного стокового раствора FI.

Чтобы избежать агрегации во время подготовки и очистки, также оптимизируйте параметры визуализации под микроскопом для обеспечения здорового роста клеток. Инокулируйте ночную культуру E 3 92 Lambda LZ one PPL star D в среду LBM. При плотности клеток OD 600 около 0,6 индуцируйте экспрессию лиганда в водяной бане-шейкере при 42 °C.

Продолжайте инкубацию при 37 °C до появления признаков лизиса. Культура станет прозрачной. Теперь добавьте 2% хлороформ и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре.

Затем перенесите фаговый лизат в бутыли объемом 250 миллилитров и центрифугируйте культуру. После этого соберите супернатант, содержащий частицы фага, и проведите второе центрифугирование для удаления видимого дебриса в соответствии со стандартными протоколами титрования фагов. Измерьте концентрацию фага, затем очистите фаг с помощью градиента хлорида цезия и оцените активность с помощью DPI для подготовки aro-пластинок.

Очистите шесть предметных стекол 70% ethanol. Расположите пять стекол, как показано на рисунке, и закрепите их лентой. Затем налейте раствор 1.5% aros в среде на закрепленные стекла.

Поместите последний предметное стекло сверху, стараясь избегать образования пузырьков воздуха. Сверху положите груз и дайте AROS остыть в течение примерно 30 минут. Извлеките четыре боковых предметных стекла и оберните блок предметных стекол пищевой пленкой.

Используя ночную культуру трансформированных бактерий в качестве инокулята, вырастите культуру в среде LBMM, осадите один миллилитр бактерий центрифугированием и ресуспендируйте их. С помощью наконечника с широким отверстием перенесите клетки в 20 µL ледяной среды LBMM.

Добавьте 20 µL очищенного фага. Осторожно перемешайте и инкубируйте сначала на льду в течение 30 минут для абсорбции фага. Затем выдержите в водяной бане при температуре 35 °C в течение пяти минут.

Для инициации инъекции ДНК фага разбейте любые клеточные агрегаты путем перемешивания. Разведите смесь в соотношении 1:10 в среде LBMM. Затем поместите её на агариковый слой LBM для агробактерий.

На предметное стекло нанесите 1 µL смеси фагов и клеток. После впитывания осторожно накройте образец вторым предметным стеклом. Начните с получения серии изображений в канале YFP для начального временного интервала.

Сделайте серию из 15 изображений с интервалом 200 nanometer по оси Z. Кроме того, получите одно изображение в фокусе с использованием фазово-контрастного канала и канала m cherry. Затем запишите таймлапс-видео, чтобы проследить за дальнейшей судьбой инфицированной клетки.

Чтобы минимизировать выцветание и фототоксичность во время записи таймлапс-видео, используйте одно изображение в позиции Z для каждого канала в каждой временной точке; снимайте образец в фазовом контрасте, а также в каналах YFP и M cherry с интервалом в 10 минут на протяжении примерно четырех часов. Начните анализ изображений с ручного подсчета фагов, а также фиксируйте их локализацию и длину клетки. В начальный период времени отмечайте судьбу клеток: литическая, лизогенная или неинфицированная.

Также зафиксируйте время лизиса и любую другую необходимую информацию, просмотрев таймлапс-видео; извлеките дополнительные количественные данные, такие как уровень флуоресценции в отдельных клетках с течением времени, используя алгоритмы автоматического распознавания клеток и отслеживания клеточных линий. Как правило, бляшки флуоресцентно меченных фагов значительно меньше бляшек дикого типа, а сигналы YFP и DAPI успешно очищенного фага колокализуются. Эти данные объединяют наборы изображений фазового контраста, каналов YFP и M cherry, а также соответствующие наложенные изображения из таймлапс-видео.

Отдельные фаги отчетливо видны на начальном этапе наблюдения. Здесь видны две клетки, каждая из которых инфицирована одним фагом, и одна клетка, инфицированная тремя фагами. Как правило, на поверхности клетки наблюдается некоторое количество фагов, в то время как другие фаги остаются неабсорбированными.

Со временем результат инфицирования становится различимым. Спустя 80 минут обе клетки, инфицированные одиночными фагами, перешли на литический путь. При внутриклеточном производстве новых фагов клетка, инфицированная тремя фагами, перешла на лизогенный путь, который характеризуется экспрессией mCherry с пре-промотора.

После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как создать очищенный сток фагов для заражения бактерий E. coli фагом лямбда, а также как проводить визуализацию жизненного цикла фагов под микроскопом в режиме реального времени.