Режиссер Сотовая самосборки для изготовления Cell-Производные Кольца тканей для биомеханического анализа и тканевая инженерия

Общая цель этой процедуры заключается в создании 3D-конструкций тканей из агрегированных клеток и клеточного матрикса, которые могут быть использованы для функционального анализа. Это достигается путем предварительного фрезерования поликарбонатной формы для создания кольцевых колодцев с круглым дном. Затем полидиметилслоун или PDMS заливается на поликарбонатную форму для создания шаблона.

Затем шаблон PDMS используется для формирования колодцев. Последний шаг заключается в том, чтобы засеять клетки в арос-лунки, чтобы они могли агрегироваться и образовывать связующие тканевые кольца. В конечном счете, этот метод может быть использован для достижения клеточной самосборки и тканевой инженерии с использованием различных типов клеток, а также позволяет анализировать вклад клеток и клеточного внеклеточного матрикса в структуру и функцию тканей.

Основное преимущество этого метода перед другими подходами к тканевой инженерии заключается в том, что мы можем создавать тканевые конструкции полностью из клеток и внеклеточного матрикса, который они производят быстрее, чем сообщалось ранее, и в формате, который способствует механическому анализу. Начните с фрезерования куска поликарбоната толщиной в полдюйма для создания 15 кольцевых лунок с круглым дном и диаметром центральной стойки два миллиметра. Очистите поликарбонатную форму, чтобы удалить пластиковый мусор, образовавшийся в процессе фрезерования, и дайте форме высохнуть. Далее смешайте PDMS в соотношении 10 к одному основному отвердителю, дегазируйте раствор, чтобы удалить все пузырьки воздуха, а затем залите его в форму из поликарбоната.

Затем снова дегазируйте смесь на форме, чтобы удалить оставшиеся пузырьки воздуха, и отверждайте PDMS в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение четырех часов, пока PDMS отверждается. 2%AROS в DMEM после отверждения Осторожно удалите шаблон PDMS, медленно отделив его от поликарбоната, затем промойте PDMS водой с мылом и автоклавом вместе с раствором DMEM AROS. Теперь поместите шаблон PDMS для автоклава на ровную поверхность и заполните его расплавленным аросом, сначала пипетируя арос в каждую из форм центральной стойки, а затем пипетируя арос в пространство вокруг них.

Дайте аросу застыть в течение примерно 15 минут. Затем переверните форму, чтобы освободить арос от PDMS. Отрежьте лишние аросы вокруг каждой лунки, а затем поместите по одному аросу в каждую лунку 12-луночной пластины. Сейчас.

Добавьте питательную среду для клеточных культур вокруг внешней стороны лунки, не закрывая верхнюю часть лунки. Затем поместите пластины в инкубатор, чтобы они могли сбалансироваться, пока клетки готовятся. При 90% слиянии трипсина, гладкомышечных клеток аорты крысы и реанимации.

Суспензируйте клетки в концентрации от пяти до 10 до шести клеток на миллилитр. Затем пипеткой впрыскивают 100 микролитров суспензии ресуспендированных клеток в каждую из уравновешенных лунок. С помощью круговых движений прикладываем ячейки к каждой из лунок.

Поместите тарелки в инкубатор, чтобы они спокойно сидели в течение 24 часов. Меняйте среду каждые два дня, отсасывая среду вокруг лунки, а затем заполняя каждую лунку до тех пор, пока форма арос полностью не погрузится в воду. А по завершении культуры наполните PBS небольшую чашку Петри.

Извлеките каждое кольцо из формы, сдвинув его через верхнюю часть центральной стойки. Поместите кольца в чашки Петри с PBS Center, кольцом под цифровой системой визуализации. Используйте программное обеспечение для определения краев для измерения толщины кольца в четырех положениях: сверху, снизу, слева и справа по его окружности.

Для проведения одноосевых испытаний на растяжение. Закрепите образец кольца на двух тонких проволочных захватах. Вытяните рукоятки до тех пор, пока к кольцу не будет приложена разрывная нагрузка в пять миллиньютонов.

Затем введите площадь поперечного сечения, рассчитанную на основе измерений толщины, и запишите расчетную длину. Предварительно сделайте восемь циклов кольца между разрывной нагрузкой и 50 кг паскаля. Напряжение со скоростью 10 миллиметров в минуту после восьмого предварительного цикла тянуло к разрушению со скоростью 10 миллиметров в минуту.

Для каждого кольца измерьте предельное растягивающее напряжение и деформацию разрушения и рассчитайте максимальный модуль касательной по полученным данным. В дополнение к функциональным исследованиям in vitro, эти живые клеточные кольца также могут сливаться с образованием тканевых трубок. Хирургическими ножницами обрежьте концы силиконовых трубок под углом, чтобы создать скошенные края, а затем автоклавируйте силиконовые трубки во время автоклавирования трубок.

Наполните чашку Петри средой, перенесите стерилизованные силиконовые держатели для трубок в шкаф биобезопасности и поместите в пустую чашку Петри. Далее извлеките кольца из лунок арос и поместите их в чашку Петри, наполненную фильтрующим материалом. Поместите силиконовые трубки в ту же чашку Петри, чтобы смочить их перед использованием.

С помощью щипцов поместите кончик силиконовой трубки в центр кольца и осторожно наденьте кольцо на силиконовую трубку. Сдвиньте кольца в соприкосновение друг с другом, осторожно проталкивая их последовательно в обоих направлениях вдоль трубки. После того, как кольца будут установлены, совместите силиконовые трубки внутри держателей из поликарбоната и прикрутите две части держателя вместе.

Добавьте в чашку Петри 55 миллилитров среды. Меняйте среды каждые три дня на время культивирования для удаления тканевых пробирок. Сначала наполните чашку Петри PBS.

Затем освободите силиконовые трубки от держателя из поликарбоната и с помощью щипцов сдвиньте тканевые трубки с силиконовой трубки в чашку. При правильном выполнении клетки оседают на дне лунок ароса и сокращаются в течение 24 часов после посадки, образуя тканевое кольцо вокруг центральной стойки в лунке Агарро, это репрезентативный график кривой напряженной деформации, полученный в результате одноосевого испытания на растяжение двухмиллиметрового тканевого кольца, созданного из гладкомышечных клеток крысы. Предел прочности на разрыв, максимальный модуль упругости при растяжении и значения деформации разрушения затем используются для сравнения механических свойств образцов тканевых колец, выращенных при различных параметрах культуры.

Механические свойства тканевых колец можно контролировать, изменяя параметры культуры, включая количество посадочных мест, длину культуры, культуральную среду и тип используемых клеток. Помимо гладкомышечных клеток крысы. Первичные, гладкомышечные клетки человека образуют тканевые кольца с аналогичной прочностью на разрыв

Мезенхимальные стволовые клетки человека также агрегируют, образуя кольца, но они не были достаточно прочными для механических испытаний. Наша система позволяет изготавливать инженерные тканевые конструкции полностью из клеток путем простого засеивания клеток в наши специальные лунки. После того, как первоначальная поликарбонатная форма будет обработана, мы можем изготовить неограниченное количество шаблонов PDMS, которые затем можно использовать для изготовления форм, поэтому дополнительное оборудование не требуется.

Система универсальна в том смысле, что мы использовали ряд различных типов клеток в системе для создания тканевых колец, и поэтому эта система потенциально может быть использована как для приложений тканевой инженерии, так и для исследований in vitro вклада клеток и внеклеточного матрикса в структуру и функцию ткани.