Режиссер Сотовая самосборки для изготовления Cell-Производные Кольца тканей для биомеханического анализа и тканевая инженерия

Общая цель данной процедуры заключается в создании трехмерных тканевых конструктов из агрегированных клеток и матрикса клеточного происхождения, которые можно использовать для функционального анализа. Это достигается путем первоначального фрезерования поликарбонатной формы для создания кольцевых лунок с круглым дном. Затем на поликарбонатную форму отливается полидиметилсилоксан (ПДМС) для создания шаблона.

Затем шаблон из PDMS используется для формирования лунок aros. Заключительный этап заключается в посеве клеток в лунки aros для обеспечения их агрегации и формирования сплошных тканевых колец. В конечном счете данный метод может быть использован для достижения клеточной самосборки и тканевой инженерии с использованием различных типов клеток, а также позволяет анализировать вклад клеток и производного от них внеклеточного матрикса в структуру и функцию ткани.

Главным преимуществом данного метода перед другими подходами тканевой инженерии является возможность создавать тканевые конструкции полностью из клеток и вырабатываемого ими внеклеточного матрикса быстрее, чем сообщалось ранее, и в формате, удобном для механического анализа. Начните с фрезерования поликарбонатной заготовки толщиной в полдюйма для создания 15 кольцевых лунок с круглым дном и диаметром центрального стержня два миллиметра. Очистите поликарбонатную форму, чтобы удалить пластиковую стружку, образовавшуюся в процессе фрезерования, и дайте форме высохнуть. Затем смешайте PDMS в соотношении основы к отвердителю 10:1. Дегазируйте раствор для удаления всех пузырьков воздуха, после чего залейте его в поликарбонатную форму.

Затем снова удалите газы из смеси в форме, чтобы избавиться от оставшихся пузырьков воздуха, и полимеризуйте PDMS в печи при 60 °C в течение четырех часов; пока PDMS полимеризуется, растворите 2% AROS в DMEM. После полимеризации осторожно снимите шаблон из PDMS, медленно отклеивая его от поликарбоната, затем промойте PDMS водой с мылом и автоклавируйте его вместе с раствором DMEM AROS. Теперь поместите автоклавированный шаблон из PDMS на ровную поверхность и заполните его расплавленным AROS, сначала дозируя AROS пипеткой в каждую форму центрального столбика, а затем заполняя пипеткой пространство вокруг них.

Дайте арос-структурам затвердеть в течение примерно 15 минут. Затем переверните форму, чтобы извлечь арос-структуры из PDMS. Отрежьте излишки арос-материала вокруг каждой лунки, а затем поместите одну лунку с арос-структурой в каждую лунку 12-луночного планшета.

Добавьте культуральную среду вокруг внешней стороны лунки aros, не затрагивая верхнюю часть лунки. Затем поместите планшеты в инкубатор для уравновешивания температуры во время подготовки клеток. При 90% слиянии обработайте гладкомышечные клетки аорты крысы трипсином и ресуспендируйте их.

Приведите клетки к концентрации 5×10⁶ клеток/мл. Затем перенесите по 100 µL ресуспендированной клеточной суспензии в каждую из уравновешенных лунок aros. При распределении клеток по лункам используйте круговые движения.

Поместите планшеты в инкубатор на 24 часа, не тревожа их. Каждые два дня заменяйте среду, аспирируя ее из пространства вокруг лунки, а затем наполняя каждую лунку до полного погружения формы aros. По завершении культивирования наполните небольшую чашку Петри раствором PBS.

Извлеките каждое кольцо из формы aros, сдвинув его вверх по центральному стержню. Поместите кольца в чашки Петри с PBS. Расположите кольцо под системой цифровой визуализации. Используйте программное обеспечение для детектирования границ, чтобы измерить толщину кольца в четырех точках по окружности: сверху, снизу, слева и справа.

Для проведения одноосного испытания на растяжение закрепите кольцеобразный образец в двух тонких проволочных зажимах. Раздвигайте зажимы до тех пор, пока к кольцу не будет приложена разрывная нагрузка 5 mN.

Затем введите значение площади поперечного сечения, рассчитанное на основе измерений толщины, и запишите длину рабочей части образца. Выполните восемь предварительных циклов нагружения кольца в диапазоне от нагрузки разрыва до 50 kilo pascal. Растягивайте образец со скоростью 10 millimeters per minute; после восьмого предварительного цикла растяните до разрушения со скоростью 10 millimeters per minute.

Для каждого кольца измерьте предел прочности при растяжении и относительную деформацию при разрыве, а затем рассчитайте максимальный модуль касания на основе полученных данных. Помимо функциональных исследований in vitro, эти кольца из живых клеток могут сливаться с образованием тканевых трубок. С помощью хирургических ножниц срежьте концы силиконовых трубок под углом, чтобы создать скошенные края, после чего подвергните силиконовые трубки автоклавированию.

Наполните чашку Петри средой, перенесите стерилизованные держатели из специальных силиконовых трубок в бокс биологической безопасности и поместите их в пустую чашку Петри. Затем извлеките кольца из лунок aros и поместите их в чашку Петри, наполненную средой. Поместите силиконовые трубки в ту же чашку Петри для увлажнения перед использованием.

С помощью пинцета поместите конец силиконовой трубки в центр кольца и осторожно наденьте кольцо на трубку. Соприкосните кольца друг с другом, аккуратно перемещая их поочередно в обоих направлениях вдоль трубки. После установки колец совместите силиконовые трубки с поликарбонатными держателями и скрутите две части держателя между собой.

Добавьте в чашку Петри 55 миллилитров среды. Заменяйте среду каждые три дня на протяжении всего периода культивирования для удаления трубок с тканью. Сначала наполните чашку Петри PBS.

Затем извлеките силиконовые трубки из поликарбонатного держателя и с помощью пинцета сдвиньте трубки с тканью с силиконовой трубки в чашку. При правильном выполнении клетки оседают на дно лунок aros и сокращаются в течение 24 часов после размещения, формируя тканевое кольцо вокруг центрального стержня в лунке Agarro s; на данном графике представлена типичная кривая «напряжение-деформация», полученная в результате одноосного испытания на растяжение тканевого кольца толщиной 2 мм, выращенного из гладкомышечных клеток крысы. Значения предела прочности на разрыв, максимального модуля упругости и деформации при разрушении затем используются для сравнения механических свойств образцов тканевых колец, выращенных при различных параметрах культивирования.

Механические свойства тканевых колец можно регулировать, изменяя параметры культивирования, включая количество высаженных клеток, продолжительность культивирования, состав питательной среды и используемый тип клеток. Помимо гладкомышечных клеток крысы, первичные гладкомышечные клетки человека также формируют тканевые кольца с аналогичной прочностью на разрыв.

Мезенхимальные стволовые клетки человека также агрегируют с образованием колец, однако они оказались недостаточно прочными для проведения механических испытаний. Наша система позволяет создавать инженерные тканевые конструкции полностью из клеток путем простого посева клеток в специально разработанные лунки aros. После изготовления исходной формы из поликарбоната мы можем создать неограниченное количество шаблонов из PDMS, которые затем используются для изготовления форм, поэтому дополнительное оборудование не требуется.

Данная система универсальна, так как для создания тканевых колец мы использовали несколько различных типов клеток; таким образом, эта система может быть потенциально применена как в задачах тканевой инженерии, так и в исследованиях in vitro для изучения вклада клеток и внеклеточного матрикса в структуру и функцию тканей.