Морфометрические анализы сетчатки Разделы
19 февраля 2012 г.
Это видео демонстрирует три типа морфометрических анализ сетчатки, которые включают в себя измерение внутренней ядерной толщины слоя, количественной количество ганглиозных клеток сетчатки (РГК) и измерения размеров РГК. Этот метод может предложить простой, но научная платформа для морфометрического анализа.
Здравствуйте, я Регина из лаборатории нейродегенеративных заболеваний кафедры анатомии Гонконгского университета. Сегодня я покажу вам, как проводить анализ прогрессии срезов сетчатки. Давайте приступим. Перед началом любого анализа срезы образцов сетчатки проходят окрашивание гематоксилином и эозином (H&E).
После этого сессия исследования сетчатки разделяется на четыре области: верхнюю периферическую, верхнюю центральную, нижнюю центральную и нижнюю периферическую. После определения областей каждого региона получают изображение при увеличении 10x40 с помощью светового микроскопа decor.
Теперь мы готовы проанализировать морфологические данные сетчатки. В этом разделе будет продемонстрировано, как измерить толщину внутреннего ядерного слоя сетчатки. Откройте программу Thorough Investigator.
Выберите параметр «40 types», затем на главной панели инструментов выберите «image open». Вкладка «file» позволяет выбрать изображение интересующего региона сетчатки для последующего анализа. Выберите тип контурной линии в выпадающем списке на главной панели инструментов.
Убедитесь, что функция автоматического перемещения включена. Вы можете увеличить изображение, нажав кнопку приближения. Вы можете использовать кнопку отдаления, чтобы уменьшить размер отображаемого изображения.
И трассировку, и образец можно перемещать в четырех разных направлениях, нажимая кнопки перемещения. Щелкните правой кнопкой мыши в окне трассировки и выберите «простую трассировку трещин» (simple crack tracing). Проведите контурную линию вдоль внутреннего края внутреннего слоя.
Если была допущена ошибка, прервите действие в окне трассировки и нажмите кнопку отмены, чтобы удалить последнюю точку рисования. Продолжайте трассировку до последней точки линии. По завершении рисования прервите действие в окне трассировки, выберите открытый контур и запустите изображение, нажав кнопку увеличения масштаба.
Щелкните левой кнопкой мыши в окне трассировки. Чтобы увеличить изображение, выберите маркер на панели маркеров в точке соединения.
После добавления всех маркеров выберите значок маркера в позиции панели маркеров и установите курсор. В центре одного из маркеров выберите «Quick Measure Angles» (Быстрое измерение углов) во вкладке, щелкните правой кнопкой мыши в окне трассировки и выберите опцию «Continuous» (Непрерывно). Измерьте угол, сначала щелкнув в центре маркера, который прилегает к выбранному маркеру.
Для определения конца линейного сегмента переместите маркер в центр области интереса. Снова продлите линию резинки до внешней границы слоя inia и отрегулируйте угол до 90 градусов.
Переместите курсор на левую трещину в нужном месте. После клика появится диалоговое окно с отображением измерения угла. Нажмите клавишу Enter, удерживая курсор мыши на этом месте.
Щелкните в окне трассировки, чтобы линия была проведена от одного конца до newly выбранного конца. Разорвите ее в окне трассировки и выберите открытый контроль. Необходимо произвести четыре измерения отростков внутреннего ядерного слоя в каждой области, где будет проведено четыре линии.
Проведите линию перпендикулярно от контрольного основания вправо до внешней границы внутреннего ядерного слоя и запустите изображение так, чтобы граница была видна четко. Если кончик линии не совпадает с внешней границей внутреннего ядерного слоя, можно либо соединить их, либо укоротить линию в режиме редактирования. Выберите режим редактирования и отметьте линию.
Щелкните по окну трассировки и выберите в поиске точку электрического управления; добавьте точку на внешней границе, при этом отредактированная точка должна находиться на той же линии. Удалите исходную точку. После этого можно будет получить выравнивание по новому лифту.
Уменьшите размер изображения, нажав кнопку отдаления. Отключите режим редактирования и нарисуйте последний сегмент линии. После отрисовки линий порядка выберите режим редактирования.
Щелкните правой кнопкой мыши в окне трассировки и соответственно установите четыре линейных сегмента. Теперь можно получить четыре значения измерений, нажав кнопку измерения CONT. Выберите эти четыре измерения и перенесите их в специализированное программное обеспечение, нажав кнопку копирования.
Чтобы сохранить данные, выберите «Сохранить как» во вкладке «Файл». Данные трейсинга можно сохранить в виде файла данных. В этой части мы количественно определим число клеток красного хвоста гага, выбрав «Изображение» — «Открыть».
На вкладке «Файл» выберите изображение интересующей вас области сетчатки для анализа. Прежде всего необходимо определить, какие клетки являются живыми, а какие — погибшими. Клетки приблизительно округлой формы с четко выраженным ядром считаются живыми ганглионарными клетками сетчатки.
Малые и плотные клетки, подобные этим, считаются таковыми. Выберите тип контурной линии из выпадающего списка на главной панели инструментов. Проведите линию вдоль границы левого фиброзного слоя, используя опцию открытого контура.
На каждом конце добавьте по одному маркеру: один на конце линии, а другой в позиции рядом с командой. Выберите иконку маркера на панели «Marker two». Установите курсор в центре маркеров.
В верхней части экрана выберите «быстрое измерение углов» (quick measure angles) на соответствующей вкладке. Затем щелкните правой кнопкой мыши в окне трассировки, выберите опцию «непрерывный» (continuous), обведите нужную область линиями-резинками и измерьте угол в 19 degree. Нажмите клавишу Enter сразу после появления диалогового окна.
Однако помните, что мышь все еще находится в том же положении. Прервите окно трассировки, чтобы от кончика можно было протянуть новую линию. Прервите запись в окне трассировки и выберите открытый контроль.
Проведите еще одну новую линию точно так же, как и с другого конца. Таким образом мы создали две границы, внутри которых подсчитывается количество клеток RAG1. Выберите один тип маркера и прикрепите по одному маркеру к каждой пятой клетке.
Выберите одну границу в качестве линии исключения, чтобы клетки, касающиеся её, не учитывались. Выберите другой тип маркера для мертвых клеток. Количество маркеров каждого типа будет отображаться рядом с соответствующей иконкой маркера.
На панели маркера «two bar» выберите режим редактирования и выберите базовую линию контура. Разорвите ее в окне трассировки и заново завершите линию. Название базовой линии контура можно получить, нажав кнопку измерения контура.
Затем количество клеток можно выразить на один миллиметр мембраны. Сохраним результат через вкладку «Файл». Данные трассировки и маркеров могут быть сохранены в виде файла данных.
В этой части будет продемонстрировано, как измерить размер клетки ганглиозного слоя сетчатки. Перейдите на вкладку «Файл» и выберите изображение интересующего вас участка сетчатки для анализа. Выберите живую ганглиозную клетку в соответствии с критериями, описанными в предыдущей части.
В окне с изображением живой клетки выберите тип контурной линии в соответствующем поле главной панели инструментов. Проведите контурную линию по окружности клетки, почти замкнув её в окне трассировки, затем выберите «закрыть контур» (end close contour). Площадь клетки будет отображена в поле «площадь» (area) в диалоговом окне контрольных измерений.
В данном видео были продемонстрированы три простых метода, позволяющих объективно проанализировать сетчатку. Надеемся, что это видео будет полезным.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видео демонстрируются три типа морфометрического анализа сетчатки, включая измерение толщины внутреннего ядерного слоя, количественное определение числа ганглионарных клеток сетчатки (RGCs) и измерение размеров RGCs. Данная методика представляет собой научную основу для проведения этих анализов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Морфометрия сетчатки
- Количественный анализ клеток
Теоретические сведения
- Здоровье сетчатки имеет решающее значение для зрения.
- Морфометрический анализ помогает в понимании заболеваний сетчатки.
- Ганглионарные клетки сетчатки жизненно важны для передачи зрительной информации.
- Подсчет RGC может дать представление о нейродегенеративных состояниях.
Цель исследования
- Продемонстрировать морфометрические методы анализа сетчатки.
- Количественно оценить ганглиозные клетки сетчатки и их размеры.
- Измерить толщину внутреннего ядерного слоя.
Используемые методы
- Подготовка образцов сетчатки.
- Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E).
- Разделение сетчатки на определенные области для анализа.
- Получение изображений при различных увеличениях.
Основные результаты
- Успешное измерение толщины внутреннего ядерного слоя.
- Количественная оценка ганглионарных клеток сетчатки.
- Оценка размеров ганглионарных клеток в различных областях сетчатки.
- Демонстрация систематического подхода к морфометрии сетчатки.
Выводы
- Представленные методы эффективны для анализа сетчатки.
- Данные методы могут помочь в понимании патологий сетчатки.
- Будущие исследования могут опираться на эту структуру для дальнейшего изучения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Объективный морфометрический анализ срезов сетчатки позволяет точно количественно оценить потерю нейронов и структурные изменения, что способствует валидации мишеней в моделях нейродегенеративных заболеваний. Снижая вариабельность измерений и повышая чувствительность к минимальным изменениям, данный подход увеличивает прогностическую достоверность при оценке терапевтической эффективности. Он представляет собой трансляционную платформу для анализа патологий сетчатки на различных этапах разработки лекарственных препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения плотности ганглиозных клеток сетчатки и изменений размера тел клеток в моделях заболеваний.
- Операционная ценность: Способствует снижению биологических рисков за счет воспроизводимого измерения толщины внутреннего ядерного слоя и морфометрии клеточных слоев.
- Прогностическая ценность: Облегчает приоритизацию портфеля препаратов, предоставляя абсолютные, сопоставимые морфометрические данные для сравнительного анализа между исследованиями.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для последующих этапов исследования с помощью стандартизированных протоколов получения изображений и трассировки по определенным областям.
- Количественные результаты: Получение абсолютных значений длины и размера, которые можно напрямую экспортировать в аналитические файлы, что повышает согласованность данных.
- Масштабируемость: Обеспечение надежной оценки соединений за счет снижения вариабельности между наблюдателями и повышения чувствительности при выявлении минимальных изменений в сетчатке.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Соответствует стратегиям разработки трансляционных биомаркеров, связывая потерю RGC и изменения толщины слоев с терапевтическими результатами в моделях глаукомы и эксайтотоксичности.
- Доклиническая преемственность: Обосновывает решения о переходе к следующим этапам разработки с учетом рисков за счет использования объективных и воспроизводимых морфометрических конечных точек в различных областях сетчатки.
- Механистическое снижение рисков: Ориентировано на прогностическую оценку путем выделения структурных изменений, не зависящих от функциональных анализов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в континуум открытий — от ранней валидации мишени и идентификации лидов до доклинической оценки, обеспечивая получение структурных данных, которые дополняют функциональный анализ в моделях заболеваний сетчатки.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей реализации процессов путем количественной оценки числа клеток, их размера и толщины слоев в определенных областях сетчатки.
- Скрининг: Гарантирует готовность анализа и воспроизводимость результатов благодаря стандартизированному анализу срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, и использованию программного обеспечения для трассировки.
- Аналитика: Обеспечивает количественное измерение зависимых переменных (количество клеток, размер сомы, толщина слоя), что позволяет проводить статистическое сравнение между группами лечения.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет использования структурных конечных точек, релевантных для таких моделей, как NMDA-индуцированная эксайтотоксичность, ишемия-реперфузия и глаукома.
- Повторное использование в масштабах предприятия: Создает воспроизводимую методику морфометрии сетчатки, применимую для различных моделей заболеваний и терапевтических вмешательств.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение предсказательной уверенности в валидации мишени за счет снижения механистической неопределенности при нейродегенерации сетчатки.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость морфометрических измерений независимо от оператора и места проведения исследований.
- Стратегическая ценность: Более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних этапах за счет раннего обнаружения структурных биомаркеров.
- Влияние на портфель: Приоритизация и принятие решений о продвижении проектов с учетом рисков на основе количественных изменений структуры сетчатки.
Особенности реализации
- Требуемый опыт в области гистологии, микроскопии и работы с программным обеспечением для морфометрии (Stereo Investigator).
- Необходимое оборудование включает микроскоп в светлом поле, компьютеризированную систему трассировки и программное обеспечение для анализа изображений.
- Стандартизация между исследовательскими группами требует строгого соблюдения протокола определения областей, техники трассировки и репликации измерений.
- Особенности адаптации для различных модельных систем включают корректировку увеличения, отбора проб областей и критериев идентификации клеток.
- Практические ограничения включают зависимость от качества срезов ткани и стабильности окрашивания для точного определения границ.
