Использование плазмонных наноструктур и фотонных кристаллов для работы с улучшенными микро-и наночастиц Манипуляция

Общая цель данной процедуры заключается в захвате биологических объектов микронного размера с помощью плазмонных и фотонно-кристаллических пинцетов. Это достигается путем предварительного изготовления плазмонной или фотонно-кристаллической подложки. Затем подготавливают биологический образец, добавляя BSA в раствор клеток и обеспечивая достаточное расстояние для раствора клеток под верхним покровным стеклом.

Затем лазер юстируют по микроскопу, оснащенному соответствующей системой фильтров. После этого микроскоп фокусируют на образце и осуществляют захват. Наконец, микро- или наноразмерные частицы могут быть захвачены при сниженной интенсивности падающего излучения с помощью плазмонных или фотонных кристаллическх наноструктур.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как традиционные оптические пинцеты, является то, что преобразование оптических полей с помощью плазмонных и фотонно-кристаллических наноструктур снижает интенсивность, необходимую для захвата мелких частиц, например клеток; кроме того, этот метод не требует сильно сфокусированного луча, что снижает риск фотоповреждения клеток при облучении. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы во многих областях биологии, таких как взаимодействие клеток между собой и изучение различных сил в биологических системах. Он также может стать полезным инструментом для производства в микро- и нанотехнологиях, обеспечивая точное манипулирование микро- и наночастицами. Для создания массива золотых наночастиц с использованием электронно-лучевого испарителя и хрома в качестве адгезионного слоя нанесите золото на стеклянную покровную пластинку методом испарения до достижения толщины 20 nanometers.

Очистите образец с помощью кислородной плазмы в течение примерно одной минуты, чтобы удалить органические загрязнения с поверхности. После инициирования самосборки монослоя полистирола нанесите жидкость на образец капельным методом, инкубируйте в течение примерно одного часа, затем промойте образец большим объемом воды для удаления неадсорбированных сфер и высушите на воздухе. После испарения монослоя нанесите второй слой золота толщиной 20 nanometer на латексные сферы монослоя для формирования массива случайных наночастиц золота.

Массив наночастиц готов к нанесению биологического образца. Поместите подготовленный предметное стекло с наночастицами на предметный столик флуоресцентного микроскопа. Следующим шагом является подготовка ядер клеток мыши для оптического захвата.

Начните с ядер клеток мыши, помеченных аниновым оранжевым, чтобы предотвратить прилипание ядер к подложке. Поместите ядра клеток в небольшой флакон и добавьте 10% BSA в PBS в концентрации от одного до 10 BSA, перемешивая на вортексе. Затем нанесите пипеткой 5 µL раствора ядер в BSA на подготовленный предметное стекло.

Чтобы обеспечить расстояние между ядрами и покровным стеклом, поместите вокруг капли стопку из двух разделительных покровных стекол, а затем накройте сверху еще одним покровным стеклом. Для захвата и одновременной визуализации используйте модифицированную конфигурацию флуоресцентного микроскопа, включающую обходной возбуждающий фильтр и два специальных дихроичных светоделителя. Оптический пинцет сконструирован путем направления гелий-неонового лазера мощностью 35 milliwatt через микроскоп zes axio imager D one M, оснащенный набором фильтров GFP 17, который был модифицирован для того, чтобы лазерное излучение с длиной волны 633 nanometer достигало образца.

Микроскоп сфокусирует лазерный луч на образце, после чего луч будет дифрагировать либо на подложке с плазмонными наночастицами, либо на дифракционной решетке. Для получения изображений ядер клеток, диаметр которых составляет около пяти микрон, используйте Zeiss LDEC epi plan с объективом Neola 50 x. Сначала поместите образец на объектив и сфокусируйтесь на плоскости с наибольшим количеством ядер, так как они расположены на поверхности подложки.

Затем сфокусируйте микроскоп на ядре, которое необходимо захватить, найдя свободно плавающие ядра клеток над слоями клеток на поверхности. После этого совместите точку лазерной ловушки с частицей. В этот момент ядро должно быть захвачено и сохранять свое положение в лазерном пятне даже при перемещении предметного столика.

Ядра мышиных клеток, находящиеся в фокальной плоскости микроскопа, вероятно, будут дрейфовать под воздействием слабого микрофлюидного потока, вызванного нагревом и испарением образца, в то время как ядра в ловушке останутся в одном положении. На данном рисунке представлена микрофотография самособирающихся золотых наночастиц, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа, диаметр каждой из которых составляет примерно 450 нанометров. Здесь представлено изображение плазмонного субстрата, полученное методом ближнепольной сканирующей оптической микроскопии, при котором распределение наночастиц является разреженным, что демонстрирует ближнепольное излучение.

Длина волны возбуждающего лазера составляет 633 нанометров; здесь представлен спектр эффективности рассеяния плазмонной подложки с пиком на 624 нанометрах. Спектр эффективности поглощения плазмонной подложки демонстрирует пик на 668 нанометрах. Золотые наносферы случайным образом распределены по двумерной области размером один на один квадрат.

Здесь показаны микрометры. Каждый синий круг представляет собой центр наносферы. На данных панелях представлены распределения рассеивающего поля в плоскостях наблюдения, которые параллельны массиву наносфер, расположенных случайным образом.

На этих графиках показаны минимальные интенсивности лазера, необходимые для поддержания ловушки, в зависимости от скорости потока окружающей жидкости. Благодаря использованию плазмонного захвата, все значения оптической интенсивности измерялись в плоскости образца под объективом микроскопа. На каждой панели представлены результаты измерений для одиночных полистирольных микросфер разного диаметра.

На вставках показаны соответствующие микрофотографии частиц. Масштабные отрезки на всех изображениях соответствуют пяти микрометрам. На данном графике представлена зависимость наклона аппроксимирующей прямой, проходящей через начало координат на предыдущих графиках, от размера частиц.

Для плазмонного захвата. Планки погрешностей отображают стандартные отклонения линейных аппроксимаций. Результаты показывают, что для поддержания достаточной стабильности захвата более крупных частиц требуется большая интенсивность лазерного излучения.

На данной схеме показано усиление оптического захвата с использованием одномерных периодических наноструктур. Падающий пучок дифрагирует на периодической наноструктуре в дальней зоне. Здесь представлено распределение интенсивности света с двумя ортогональными поляризациями на поверхности алюминиевой решетки.

При периоде 417 нанометров, полученном с помощью моделирования методом конечных разностей во временной области, распределение нормируется по интенсивности на плоской алюминиевой поверхности. На этих рисунках показан удерживающий потенциал для частиц, находящихся непосредственно над градиентной поверхностью, в зависимости от положения частицы. Для полистироловых шариков размером CA 350 нанометров и DA 1 микрометр белые круги иллюстрируют размеры частиц.

На вставках показан удерживающий потенциал над плоской алюминиевой поверхностью. Сравнение приведено для одного и того же размера частиц. Значения нормализованы для каждого размера частиц.

Для всех рисунков с результатами моделирования методом FDTD поле зрения составляет 10 на 8 мкм². Здесь представлены эффективность ловушки и минимальная интенсивность захвата, измеренные для полистирольных микросфер различных размеров при поляризации луча, перпендикулярной линиям градиента. На вставке показана асимметрия ловушки по эффективности захвата при перемещении полистирольной микросферы размером 3,87 мкм перпендикулярно и параллельно линиям градиента.

Здесь представлено схематичное изображение угла перемещения частицы. На этой вставке показана зависимость усиления от направления перемещения для различных поляризаций и размеров частиц. Сплошная линия показывает значительную асимметрию, которая достигается при падающем свете, поляризованном перпендикулярно градиенту, а пунктирная линия —

Небольшая асимметрия наблюдается при падающем свете, поляризованном параллельно градиенту. На этих панелях представлена демонстрация захвата флуоресцентного полистирольного шарика диаметром 590 нанометров. Красный круг указывает положение лазерного пятна, так как лазерный луч изначально был слишком тусклым, чтобы его можно было видеть.

При более высокой мощности частица удерживается в пятне. По мере снижения мощности броуновское движение частицы преодолевает удерживающую силу, что позволяет частице вырваться. В данном случае для ядра флуоресцентной клетки рака яичников минимальная интенсивность, необходимая для инициации захвата, составила 16 micro watts per micrometer squared, что было достигнуто при использовании объектива с увеличением 20 x.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создать оптическую ловушку низкой интенсивности для неинвазивного манипулирования биологическими образцами микро- и наноразмеров с использованием плазмонных и фотонно-кристаллических наноструктурированных подложек.