Сотовая Добыча липидов для целевой Стабильный изотопного разбавления жидкостной хроматографии-масс-спектрометрического анализа

Метод направлен на точное количественное определение клеточных биоактивных метаболитов липидов с помощью комбинации разбавления стабильных изотопов, cNOR-фазы, жидкостной хроматографии, захвата электронов, атмосферного давления, химической ионизации и масс-спектрометрии. Начните со сбора образцов среды и клеток и добавьте внутреннюю стандартную смесь, меченную тяжелыми изотопами. Экстрагируйте биологически активные липиды с помощью органического растворителя, затем получите биоактивные липиды с помощью реагента для захвата электронов, чтобы точно определить количество биоактивных липидов с помощью жидкостной хроматографии.

Масс-спектрометрия с помощью LCMS-анализа клеточного лизата и результатов среды точно определяет концентрацию целевых биоактивных липидов и уровни отдельных Anant ER. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как жидкостная хроматография с обратной фазой, масс-спектрометрия и другие методы LCMS, заключается в том, что отдельные особи и пыльцы точно количественно оцениваются с помощью хроматографии car normal phase и стабилизированного разбавления изотопов. Полученные данные могут дать ценную информацию о ферментативных путях, функционирующих в клетке.

На каждую 10-сантиметровую пластину адгезита клетки собирают по три миллилитра среды в стеклянной центрифужной пробирке объемом 10 миллилитров. Далее дважды промойте клетки PBS. Затем добавьте один миллилитр PBS, соскребите клетки с планшета и перенесите образец во вторую стеклянную центрифужную пробирку объемом 10 миллилитров.

Подготовьте восемь дополнительных пробирок с тремя миллилитрами PBS для калибровочной кривой. Затем добавьте в каждую пробирку по 10 микролитров соответствующего калибровочного стандарта. Выровняйте каждый испытуемый образец из трех миллилитров собранных клеточных культур для извлечения свободных биоактивных липидов.

Добавьте 10 микролитров внутренней стандартной смеси в каждый калибровочный стандарт и уравновесьте образец в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы обработать образцы пятью миллилитрами датилового эфира и поместите в шейкер на 30 минут. Центрифугируйте образцы и перенесите верхнюю органическую фазу в стеклянные центрифужные пробирки объемом 10 миллилитров. Продолжайте сушить образцы под азотом Сначала соберите собранные образцы клеток центрифугированием и повторно суспендируйте каждый поддон в двух миллилитрах PBS by Vortex Reserve 25 микролитров каждого образца для нормализации клеточного лизата.

Теперь поровну разделите каждый лизат на стеклянные центрифужные пробирки объемом 10 миллилитров. Добавьте еще два миллилитра PBS и 10 микролитров ISM в каждый образец, чтобы измерить свободные клеточные липиды и избежать щелочной деградации липидов, таких как простагландины, используйте один из дубликатов каждого образца для проведения экстракции датилового эфира, как показано ранее. Чтобы извлечь этерифицированные липиды, добавьте по пять миллилитров смеси хлороформаметанола в каждый из оставшихся образцов.

Поместите на шейкер на низкой скорости на 30 минут, затем центрифугируйте в течение 10 минут. Теперь соберите нижний органический слой и высушите образцы под азотом, чтобы обессеменить этерифицированные липиды. Добавьте 0,5 миллилитра 0,4 нормального гидроксида калия в 80% метаноле в каждую тюбик.

Инкубируйте образцы при температуре 60 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем добавьте два миллилитра PBS и отрегулируйте pH две шесть концентрированной соляной кислотой. Наконец, добавьте 10 микролитров ISM в каждый образец и приступайте к экстракции датилового эфира к высушенным образцам и калибровочным стандартам.

Добавляйте деривационные реагенты в указанном порядке. Затем сделайте образцы вихревыми и инкубируйте при температуре 60 градусов Цельсия в течение одного часа. Теперь высушите образцы под азотом перед хранением и анализом.

В этом методе используется комбинация разбавления стабильных изотопов, чии, жидкостной хроматографии, захвата электронов, атмосферного давления, химической ионизации и масс-спектрометрического анализа. Восстановите образцы и калибровочные стандарты в 100 микролитрах гексанового этанола и перенесите все образцы в пробирки ВЭЖХ с вкладышем, поместите образцы в охлажденный автопробоотборник. Создайте образец списка для анализа.

Затем настройте методы ВЭЖХ и МС с использованием параметров, описанных в таблице 1 и таблице 2 в прилагаемом письменном протоколе для нормального разделения фаз. Хиральный пакет, колонку DH до 30 градусов Цельсия, вводят образец и начинают прогон. Теперь установите MS в режим отрицательных ионов с помощью источника A PCI.

Начните с шестигранного бланка, чтобы уравновесить столбец. Далее запустите калибровочные стандартные образцы в порядке увеличения концентрации SM. Продолжайте обработку тестовых образцов питательных сред после разделения HBLC.

Добавьте столбец метанола, чтобы избежать отложения на коронной игле. Использование данных, сгенерированных на основе стандартов. Создайте калибровочную кривую, отображающую площадь образца по оси Y, и стандартную концентрацию по оси x получите уравнение Y равно MX плюс B.

Наконец, определите в тестовом образце концентрацию биоактивных липидов для клетки. Лизаты. Нормализуйте эти значения, разделив определенную концентрацию биоактивного липида на количество клеток в пластине или нормализованный на предыдущих этапах общий белок. Данные мониторинга множественных реакций указывают на наличие нескольких линолевой и арахидоновой кислот.

Окисленные метаболиты 13 и 9, удерживаемые вместе с соответствующими 13 и 9 оксоодами, образуются из линолевой кислоты. Кроме того, как ожидается, присутствуют тепловые метаболиты арахидоновой кислоты и продукты их окисления.

Существует небольшой сдвиг во времени хранения ненормированного внутреннего стандарта по сравнению с немаркированным стандартом. Важно отметить, что этот протокол также разделяет тепло и пыльцы и определяет уникальные переходы для стереоизомеров, которые могут возникнуть в результате ферментативного окисления арахидоновой кислоты или реакции с активными формами кислорода. Например, эта хроматограмма показывает разделение между r и s стереоизомерами из пяти.

Тепловой липидомный анализ является мощным методом анализа многочисленных видов липидов. Например, в этом эксперименте оцениваются и количественно оцениваются простагландины, изопсены и лейкотриен В4. В дополнение к теплотам, которые Oxo поедает и омега-гидроксилированным метаболитам, этот метод может быть оптимизирован для извлечения биоактивных липидов из других биологических матриц, таких как плазма, моча и ткани.

В некоторых случаях биоактивные липиды использовались в качестве биомаркеров ответа на окислительный стресс.