Протокол обнаружения и очистки газовой фазе Свободные радикалы в дыме сигарет
2 января 2012 г.
Спин-захвата ЭПР-спектроскопии был использован для изучения влияния растительных антиоксидантов ликопин, Пикногенол и экстракт косточек винограда на очистку газовой фазе свободных радикалов в сигаретном дыме.
Общая цель данной процедуры заключается в измерении количества свободных радикалов в основном потоке табачного дыма и оценке способности нескольких антиоксидантов к их улавливанию. Для этого сначала подготавливают фильтры, содержащие несколько различных соединений-ловушек, а также контрольные фильтры без ловушек. Затем проводят имитацию курения с использованием дыма исследуемых сигарет, который пропускают через раствор для спин-траппинга.
Затем метод электронного спинового резонанса (ЭСР) используется для записи спектров захваченных радикалов, а также эталонных образцов. Полученные спектры ЭСР подвергаются стандартному анализу с целью отделения сигнала радикалов газовой фазы от фона и количественного определения концентрации радикалов с использованием эталонного образца. В конечном итоге результаты предоставляют количественную информацию о содержании свободных радикалов в основном потоке сигаретного дыма и позволяют оценить антиоксидантную активность природных антиоксидантов с помощью ЭСР-спектроскопии со спиновым захватом.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами анализа табачного дыма, такими как газовая хроматография, является то, что ЭПР обладает специфической чувствительностью к свободным радикалам. Применение этого метода может способствовать снижению вредного воздействия табачного дыма, поскольку свободные радикалы представляют собой одну из основных групп канцерогенов. Данный метод позволяет глубже изучить свободные радикалы в табачном дыме, а также может быть применен к другим системам, таким как промышленные выхлопные газы и задымление. Национальный биомедицинский исследовательский центр в области технологий электронного спинового резонанса, также известный как ЦЭР, стал результатом нашего обширного опыта в разработке современных технологий ЭПР.
Для исследователей, занимающихся электронным парамагнитным резонансом, мы предлагаем широкий спектр услуг как для них самих, так и для биомедицинского сообщества. Мы регулярно предоставляем доступ к нашему оборудованию для введения антиоксидантов в сигаретный фильтр. Сначала растворите антиоксиданты, пикногенол и экстракт винограда в 95% ethanol, а ликопин растворите в acetone.
Отрегулируйте объемы растворителей в зависимости от растворимости антиоксидантов. Затем объедините растворенные антиоксиданты с активированным углем путем перемешивания в анаэробных условиях в течение примерно 12 часов. Анаэробные условия создаются путем барботирования аргона через смесь при перемешивании.
После инкубации профильтруйте раствор и высушите его в вакууме. Затем поместите антиоксиданты и углерод в обычный ацетатный фильтр, предварительно разрезав фильтр на две части. Вставьте растительные антиоксиданты с покрытием между двумя частями фильтра, чтобы создать «сэндвич» из антиоксидантного фильтра, и вставьте его обратно в бумажный цилиндр сигареты.
Подготовьте контрольный фильтр так же, как и антиоксидантный, за исключением того, что перед началом эксперимента антиоксидант добавлять не нужно. Исследуемые сигареты следует распаковать и выдержать в среде с постоянной влажностью, используя насыщенный раствор бромида натрия, в течение как минимум двух дней. Возьмите сигаретные гильзы с табаком и прикрепите их к комбинированному фильтру.
Выполните имитацию курения для рутинного анализа при температуре окружающей среды с использованием однопортового устройства для курения, которое состоит из водного аспиратора или вакуумного насоса/воздушного компрессора, подключенного к узлу спин-захвата через Т-образное соединение с одним открытым концом. Используйте расходомер для проверки потока газа и установите его на уровне примерно 2,2 стандартных кубических фута в час, отрегулировав клапан, расположенный между насосом и вентиляционным отверстием. Раскуривайте исследуемые сигареты интенсивными затяжками объемом 35 мл продолжительностью две секунды, повторяя процедуру каждые 60 секунд.
Открытый конец устройства для курения следует закрывать для совершения затяжек и оставлять открытым в перерывах между ними. Когда конец открыт, тяга через сигарету минимальна, что соответствует условиям между затяжками. Сделайте 10 интенсивных затяжек для каждой сигареты, собирая свободные радикалы газовой фазы путем пропускания основного потока сигаретного дыма через фильтровальную подушку Кембриджа с последующим введением в раствор для спин-траппинга.
Ловушка с жидким азотом удаляет водяной пар из основного потока дыма, но существенно не влияет на радикалы газовой фазы. После последнего вдоха перенесите аликvot раствора из барботера в стеклянную пробирку для образцов с внутренним диаметром 3 мм и длиной примерно 10 дюймов. Поскольку кислород уширяет спектры ЭСР и снижает чувствительность метода, удалите растворенный кислород из раствора методом «замораживание-откачка-оттаивание»: сначала погрузите пробирку в жидкий азот, затем откачайте воздух из раствора с помощью масляного насоса, после чего дайте раствору оттаять в атмосфере аргона.
Повторите этот метод замораживания-откачки-оттаивания несколько раз. Затем загерметизируйте пробирку в вакууме. Теперь пробирка готова.
Для последующих измерений ЭПР зарегистрируйте ЭПР-спектры в X-диапазоне на спектрометре Bruker EMX на частоте 9,34 ГГц. Для стандартных условий ознакомьтесь с письменным протоколом, в котором указаны типичные настройки спектрометра. В данных экспериментах выполните 25 накоплений ЭПР, что обычно занимает около 20 минут.
Несмотря на то, что аддукты спинового захвата остаются относительно стабильными в экспериментальных условиях спустя 12 часов, интенсивность сигналов ЭПР в бензольном растворе снизилась в пять раз. Чтобы количественно определить концентрацию захватывающего аддукта, проинтегрируйте исходный спектр ЭПР первой производной. Полученный спектр поглощения демонстрирует широкий синглетный фон, что, скорее всего, обусловлено наличием продуктов сажи и смол в дыме.
После вычитания этого фона интегрируйте отделенный триплет ловушки аддукта. Повторите процедуру для получения концентрации свободных радикалов. Значения двойных интегралов для раствора спинового захвата сравнивают со значениями для раствора нитроксильного радикала TEMPO с известной концентрацией в рамках данного эксперимента, а также с дополнительными расчетами, приведенными в письменном протоколе.
Концентрация свободных радикалов в газовой фазе основного потока сигаретного дыма составила приблизительно 7,1 × 10⁻⁹ М. На основании этих данных было определено, что общее число радикалов, захваченных из газовой фазы одной сигареты, составляет около 1,5 × 10¹⁵. В ходе данного эксперимента первоначальные измерения приводили к слабым сигналам ЭПР и низкой воспроизводимости из-за наличия влаги в потоке дыма.
Для решения этой проблемы в устройство для симуляции курения между кембриджским фильтром и раствором спин-ловушки была добавлена ловушка с жидким азотом. Ловушка с жидким азотом удаляла воду из основного потока сигаретного дыма путем быстрого замораживания и осаждения на внутренней стенке стеклянной трубки. Это значительно улучшило сигналы ЭПР и позволило получить высоковоспроизводимые результаты.
Были отмечены различные уровни антиоксидантного действия растительных антиоксидантов в отношении свободных радикалов газовой фазы в основном потоке сигаретного дыма, и представлены скорости их поглощения. Ликопин и экстракт виноградных косточек показали самые высокие показатели, в то время как для пикногенола наблюдалась более низкая скорость. После освоения эта методика может быть выполнена менее чем за один час при условии правильного проведения процедуры.
При выполнении данной процедуры важно пропускать дым через ловушку с жидким азотом. Это повышает качество ЭПР-спектров и воспроизводимость результатов после их получения. Данный метод помог исследователям в области здравоохранения и экологии обнаружить и оценить содержание опасных для здоровья свободных радикалов в различных летучих соединениях.
После просмотра видео вы должны получить четкое представление о том, как количественно определить свободные радикалы в основном потоке табачного дыма с целью снижения вредного воздействия курения.
Обзор
В данном исследовании используется ЭПР-спектроскопия со спиновым захватом для изучения эффектов поглощения газообразных свободных радикалов, присутствующих в сигаретном дыме, антиоксидантами растительного происхождения, включая ликопин, пикногенол и экстракт виноградных косточек.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Анализ табачного дыма
Теоретические сведения
- Известно, что свободные радикалы в табачном дыме способствуют его вредному воздействию.
- Антиоксиданты могут помочь смягчить эти эффекты, нейтрализуя свободные радикалы.
- Электронный спиновый резонанс (ЭСР) является чувствительным методом обнаружения свободных радикалов.
- Данное исследование направлено на количественное определение свободных радикалов и оценку эффективности антиоксидантов.
Цель исследования
- Измерение концентрации свободных радикалов в основном потоке табачного дыма.
- Оценка антиоксидантной активности выбранных растительных антиоксидантов.
- Получение данных для снижения вредного воздействия табачного дыма.
Используемые методы
- Приготовление фильтров, содержащих антиоксиданты, и контрольных образцов.
- Моделирование курения с использованием исследовательских сигарет и раствора для спин-ловушек.
- Регистрация ЭПР-спектров для анализа захваченных радикалов.
- Количественное определение концентрации радикалов с использованием эталонных образцов.
Основные результаты
- Были получены количественные данные о содержании свободных радикалов в сигаретном дыме.
- Способность антиоксидантов к поглощению радикалов оценивали с помощью ЭПР-анализа.
- Была определена концентрация свободных радикалов приблизительно 7.1 x 10^-9 M.
- В исследовании подчеркиваются преимущества ЭПР по сравнению с традиционными методами анализа табачного дыма.
Выводы
- ЭПР-спектроскопия со спиновым захватом эффективна для анализа свободных радикалов в табачном дыме.
- Растительные антиоксиданты демонстрируют потенциал в нейтрализации вредных свободных радикалов.
- Данный метод может быть применен к другим системам, расширяя понимание динамики свободных радикалов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет проводить количественное определение и оценку способности к поглощению свободных радикалов в газовой фазе основного потока сигаретного дыма с помощью ЭСР-спектроскопии со спиновым захватом, предоставляя высокочувствительный метод оценки антиоксидантной эффективности. Этот подход способствует валидации мишеней в токсикологических исследованиях, обеспечивая измеримые конечные точки способности к поглощению радикалов, что может быть использовано при разработке стратегий по снижению рисков при создании табачных изделий. Путем идентификации природных антиоксидантов с высоким поглощающим потенциалом, таких как ликопин и экстракт виноградных косточек, данный метод способствует механистическому снижению рисков и повышению прогностической достоверности при скрининге вмешательств на ранних стадиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать пути токсичности, опосредованные свободными радикалами в сигаретном дыме.
- Практическая ценность: обеспечивает количественные показатели для оценки антиоксидантной способности к поглощению радикалов в газовой фазе.
- Прогностическая ценность: позволяет приоритизировать природные соединения на основе эффективности поглощения радикалов в биологически релевантной матрице.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные, воспроизводимые сигналы ЭПР для количественного определения концентраций захваченных радикалов.
- Масштабируемость: использование доступных антиоксидантов, полученных из промышленных побочных продуктов (томатов, вина), обеспечивает потенциал для крупномасштабного скрининга.
- Повторное использование платформы: метод ЭПР со спиновым захватом может быть адаптирован для анализа других систем летучих соединений, помимо табачного дыма.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: Связывает антиоксидантную активность по поглощению радикалов со снижением количества канцерогенных радикальных аддуктов в моделях легочной ткани.
- Механистическое снижение рисков: Разъясняет зависимости «структура — активность» антиоксидантов при нейтрализации радикалов в газовой фазе.
- Прогностическая достоверность: Количественный анализ методом ЭПР позволяет сравнивать скорость поглощения радикалов для различных соединений при принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод применим в рамках рабочих процессов раннего этапа поиска, где генерация свободных радикалов является ключевым механистическим конечным показателем, в частности, при проведении токсикологического скрининга и исследований в области гигиены окружающей среды.
- Фундаментальная биология: Позволяет проверять гипотезы о механизмах окислительного стресса, индуцированного радикалами сигаретного дыма.
- Скрининг: Обеспечивает разработку методов анализа антиоксидантных соединений с использованием спин-ловушек в качестве количественного метода детекции.
- Аналитика: Интегрирование сигнала ЭПР обеспечивает точное измерение концентрации радикалов для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Позволяет соотнести данные о поглощении радикалов in vitro с потенциальным снижением индуцированного радикалами повреждения ДНК и липидов in vivo.
- Промышленное применение: Детекция радикалов на основе ЭПР представляет собой универсальную платформу, применимую для анализа промышленных выбросов, побочных продуктов горения и экологического мониторинга.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прямое измерение свободных радикалов в газовой фазе снижает неопределенность механизмов путей токсичности табака.
- Операционная ценность: Стандартизированная подготовка проб и количественный анализ методом ЭПР повышают воспроизводимость результатов в разных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает выбор антиоксидантов для технологий фильтрации на основе данных, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях разработки продукта.
- Влияние на портфель: Облегчает приоритизацию натуральных поглотителей с учетом рисков на основе количественной эффективности и масштабируемости поставок.
Особенности реализации
- Для точного получения и интерпретации сигналов требуются экспертные знания в области ЭПР-спектроскопии и химии спинового захвата.
- Оборудование включает ЭПР-спектрометр X-диапазона, систему вакуумного уплотнения и ловушку с жидким азотом для удаления влаги.
- Стандартизация между исследовательскими группами требует согласованных параметров имитации курения и протоколов приготовления растворов антиоксидантов.
- Адаптация к другим модельным системам требует подтверждения совместимости спиновых ловушек и стабильности радикалов в новых матрицах.
- Практические ограничения включают уширение сигнала из-за присутствия кислорода и помехи от твердых частиц, что требует вычитания фона и дегазации методом замораживания-оттаивания с откачкой.
