Мониторинг Расколотая активность каспазы-3 и Апоптоз Иммортализованные Олигодендроглиальные Клетки с использованием живых клеток и цифровой обработки изображений Cleaveable флуорогенных краски Подложки После калий-индуцированной деполяризацию мембраны

Эта процедура позволяет контролировать гибель олиго-DDR-глиальных клеток в режиме реального времени. Для этого сначала культивируют клетки, а затем подготавливают клетки к визуализации живых клеток. Следующим шагом является проведение лечения клеток и мониторинг эффектов с помощью флуоресцентной микроскопии.

Заключительным этапом является проведение анализа данных. В конечном счете, результаты показывают скорость гибели клеток в клеточной популяции после лечения или стимуляции путем мониторинга ядерной флуоресценции от фтор-красителя, активированного каспазой. Основным преимуществом этой методики перед существующими методами, такими как иммуноокрашивание, является возможность сбора нескольких временных точек одновременно.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной биологии, такие как реакция на фармакологические, реагентные и различные методы лечения. Теперь этот метод может дать представление о смерти в клеточных культурах. Он также может применяться к другим системам, таким как ex vivo, органотипическим тканям, включая срезы мозга.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, поскольку они приспосабливаются к работе с живыми тканями, а не с фиксированными тканями. Визуальная демонстрация этой техники важна, так как существует множество этапов подготовки образцов живых клеток по сравнению с неподвижной тканью. Сначала замораживают увековеченные глиальные клетки N 19 oligo droog в водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, пока клетки размораживаются.

Добавьте семь миллилитров DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицина в 10-сантиметровую чашку для культивирования. Затем добавьте клеточную суспензию по каплям в тарелку и осторожно взбалтывайте чашку Петри, чтобы равномерно распределить клетки. Культивируйте клетки при температуре 34 градуса Цельсия в 5-центовом углекислом инкубаторе в течение четырех часов после четырех часов.

Отсасывайте среду из планшетов, чтобы удалить остатки ДМСО. Криопротектор. Замените семью миллилитрами свежей среды после четырех-семи дней роста. Когда клетки достигнут 70-80%, Confluence отсасывают среду и пипеткой капают один миллилитр капель на лист клетки, инкубируют комнатной температурой в течение пяти минут.

Затем соберите из клеток следующее семя, 10-сантиметровую чашку для культуры тканей с собранными клетками в плотности от 0,1 до 10 до шести клеток на миллилитр, и поместите эту чашку в инкубатор для культуры тканей. После еще одного массажа клетки могут быть покрыты для экспериментов по визуализации живых клеток. Для этого собирают клетки, как и раньше, затем удаляют 30 микролитров клеточной суспензии и подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра.

Затем с помощью стерильных щипцов установите стекла без покрытия. В лунки шестилуночного планшета добавьте ячейки в лунку с плотностью 0,1 умножить на 10 к шести ячейкам на миллилитр. В двух миллилитрах фенола DMEM среда с высоким содержанием глюкозы, дополненная 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицином, позволяет клеткам расти в течение ночи при 34 градусах Цельсия и 5% углекислого газа перед трансфекцией.

На следующий день смешайте 100 микролитров сыворотки со свободными средами от 0,5 до 4 микрограммов очищенной плазмиды, ДНК и четыре микролитра гена FU hd. Осторожно перемешайте смесь дважды, а затем дайте ДНК сложиться при комнатной температуре в течение пяти минут. По истечении времени инкубации добавьте смесь ДНК гена FU HD непосредственно в культивируемые клетки.

Осторожно наклоните тарелку, чтобы перемешать. Затем культивируйте клетки в течение дополнительных 48 часов при температуре 34 градуса Цельсия и 5% углекислого газа перед обработкой или экспериментом. Сначала включите блок управления прибором LCI Cham light live cell.

Сделать это нужно за три часа до начала эксперимента, чтобы обеспечить тщательный прогрев ступени. Как минимум, блок управления должен быть включен за час до начала эксперимента. Затем, работая в проточном колпаке, распылите на камеру для культуры легкого магнитного типа LCI Cham и щипцы 70% этанола и дайте им высохнуть в течение пяти минут.

Извлеките клетки из инкубатора и рассмотрите их под микроскопом, чтобы подтвердить, что они здоровы. Клетки должны выглядеть в виде дюранта и хорошо располагаться на стекле стеклянной крышки с многочисленными мембранными отростками. Клетки с уменьшенным числом расширений процесса или ядром неправильной формы, вероятно, подвергаются стрессу от трансфекции и непригодны для дальнейших экспериментов при работе в проточном колпаке.

Наклоните шестилуночную пластину и снимите крышку с помощью щипцов. Быстро поместите защитную ячейку лицевой стороной вверх в нижнюю пластину камеры. Не допускайте высыхания чехла.

Затем прикрепите магнитный основной корпус камеры для культивирования и добавьте 500 микролитров среды из оригинальной шестилуночной пластины на верхнюю часть крышки. Повторное использование среды снижает нагрузку на клетки, вызванную изменениями окружающей среды, а также может быть полезно для оценки внеклеточных секретируемых факторов. После добавления фильтрующего материала поместите стеклянную крышку на камеру для культивирования и используйте оплетку салфеток Kim с содержанием 70%, чтобы удалить остатки материала, которые могут помешать микроскопии, с нижней части защитного стекла.

Поместите камеру для культивирования в инкубатор с температурой 34 градуса Цельсия и 5% углекислым газом на 30 минут. Этот шаг обеспечит прогрев самой камеры на 34 градуса, чтобы уменьшить смещение слипа крышки. По мере того, как металл нагревается, необходимо работать с окружающим освещением помещения как можно ниже во время следующих этапов.

Во-первых, Тора предварительно приготовила элеку ядерного вида при комнатной температуре. Затем извлеките камеру для культивирования из инкубатора и быстро поместите ее в камеру микроскопа. Включите бак с 5% предварительно смешанным углекислым газом с двойным регулятором.

Затем используйте объектив с 10-кратным увеличением напряжения с лампой микроскопа, установленной на напряжение около 2,5 вольт, и временем экспозиции 240 миллисекунд. Сфокусируйтесь с помощью светлопольной микроскопии, чтобы визуализировать клетки на мониторе компьютера. Затем добавьте в клетки 80 миллимолярную концентрацию иона калия или другого индуктора апоптоза путем обмена средами с медленной и локальной перфузией с помощью перистальтического насоса.

Субстрат Nuke View 4 88 стабилен в клеточной культуре в течение экспериментов продолжительностью до 36 часов. Таким образом, можно проводить эксперименты на протяжении этого промежутка времени. Сначала настройте микроскоп для визуализации флуоресценции красного и зеленого флуоресцентного белка.

Затем нажмите на красный канал, чтобы отобразить трансфицированные клетки. Выберите и сохраните примерно 12 кадров, в которых есть несколько трансфицированных ячеек, и сохраните эти точки XY-стадии. Пусть микроскоп каждые шесть минут делает снимки в светлопольном красном канале и зеленом канале в этих сохраненных точках предметного стекла.

После сбора нескольких точек XY из повторяющихся или тройных экспериментов соберите данные отдельных экспериментов, проведенных в разные дни, и проведите анализ данных и статистическое тестирование, как описано в письменном протоколе, чтобы сравнить соотношение отрицательных клеток CASP-bay к положительным CASP-bay. Субстрат Nuke view 4 88 может указывать на повышенную скорость апоптоза культур глиальных клеток N 19 oligo DDR. После лечения с высокой концентрацией внеклеточного калия эти исходные изображения были получены с использованием объектива с 10-кратным увеличением.

Клетки N 19 трансфицировали RFP и обрабатывали либо тремя микролитрами nuke view, 4 88 субстратом для контрольных клеток, либо тремя микролитрами nuke view, 4 88 субстратом и 80 миллимолярами калия. Эти изображения показывают, что количество апоптотических клеток увеличивается с течением времени, через три, шесть и девять часов после обработки 80 миллимолярным калием в контрольных условиях значительного количества апоптоза не наблюдалось по сравнению с культурами, обработанными 80 миллимолярным калием. Наблюдаемый в контрольных условиях фоновый зеленый сигнал указывает на клетки, которые подвергаются апоптозу без добавления внеклеточного калия.

12-часовой курс достаточен для исследований, связанных с неврологическими инсультами Через 12 часов культуры, обработанные калием, продемонстрировали примерно 45% гибель клеток. Практически ни одна из клеток в контрольном эксперименте не демонстрирует апоптоза к 12-часовому временному оттенку. Хотя в других ситуациях эксперименты могут потребоваться для проведения дольше.

Этот график показывает увеличение количества трех положительных клеток каспазы в течение 12-часового эксперимента. После приставания этот метод может быть выполнен за один час, а данные могут быть собраны за ночь, если все сделано правильно. Пытаясь пройти эту процедуру, важно помнить о последовательности между процедурами после этой процедуры.

Другие методы, такие как иммуноокрашивание, могут быть использованы для изучения других нижележащих белков, участвующих в изучаемых путях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как готовить образцы для визуализации. Получите набор данных и проанализируйте их.