Изоляция LacZ экспрессирующие клетки из тканей мышей Внутреннее ухо использованием проточной цитометрии

Общая цель данного эксперимента заключается в выделении слабых Z-положительных клеток из улитки новорожденной мыши с помощью проточной цитометрии. Это достигается путем выделения большого количества улиток мыши за относительно короткий промежуток времени, чтобы сохранить жизнеспособность клеток и получить адекватную исходную ткань. На втором этапе Z-положительные клетки LAX диссоциируют, а затем мечают, чтобы подготовить ткань к сортировке.

Затем клетки сортируются с помощью проточной цитометрии. Полученные популяции LAX Z high и lax low могут быть затем использованы для дальнейших экспериментов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований уха, например, каковы профили генов или конкретные клеточные популяции во внутреннем ухе.

Демонстрировать процедуру будет студент-медик поколения А Таха из нашей лаборатории. Сначала заполните 35-миллиметровые чашки Петри HBSS и поместите их на ледяную глыбу. Затем, после использования ножниц по радужной оболочке, обезглавили от 12 до 15 лет, усыпили постнатального аксона, нулевого до трехдневного аксона, двух вялых репортеров и мышей дикого типа.

Поместите головки на 60-миллиметровую чашку Петри на ледяной глыбе. Далее с помощью щипцов Дюмона и ножниц для радужной оболочки глаза удалите нижнюю челюсть и язык из головы, а затем прорежьте основание черепа на уровне его палитры. Теперь удалите верхнюю кожу икры и пересеките основание черепа, вставив ножницы в нижнюю часть большого затылочного отверстия до середины нёба.

Сделайте еще один разрез ножницами от среза от края нёба до верхней части теленка с обеих сторон. Будьте осторожны, чтобы не повредить глазную капсулу. Затем завершите изоляцию височной кости, сделав 2 разреза под углом 45 градусов, начиная с верхней стороны каркаса и магнума, продолжая до коронального разреза на твердом небе.

Затем поместите изолированные височные кости в 35-миллиметровые чашки Петри, содержащие HBSS, на ледяную глыбу и перенесите ледяную глыбу в стерильный капюшон. Далее заполните еще одну 35-миллиметровую чашку Петри, на этот раз PBS, и поместите ее на ледяную глыбу. С помощью двух щипцов номер 55.

Начните микродиссекцию с аккуратного удаления коры, ствола мозга и мозжечка из височной кости, расположенной над глазной капсулой. Затем, не удаляя глазную капсулу, откалывайте части кохлеарной капсулы, начиная от входа вестибулярного кохлеарного нерва и продолжая в глазную капсулу. Вслед за обнажением основания улитки аккуратно вытяните кортиальный орган и окружающие ткани.

Затем, начиная с основания, удалите все оставшиеся спиральные ганглии и полосы и перенесите улитку в чашку Петри, заполненную первой пипеткой PBS. 50 микролитров стерильного PBS в центр одной-двух лунок шестилуночной чашки для культуры без покрытия. Затем перенесите не более 20 аксинов, по две слабые улитки в каждую каплю PBS.

Далее разогрейте 50 микролитров аликвот 0,125% трипсина в течение примерно двух минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. А затем добавьте трипсин в улитку. Следя за тем, чтобы не встряхнуть блюдо.

Инкубируйте улитку при температуре 37 градусов Цельсия в течение восьми минут. Прекратите процесс трипсина, добавив 50 микролитров ингибитора трипзина соевых бобов в каждую каплю, а затем добавьте еще 50 микролитров полной среды, установив дозу пипетки P 200 на 125 микролитров. Используйте тупой наконечник для дозатора объемом 300 микролитров, чтобы аккуратно погладить клетки 80 раз, стараясь не создать пузырьков.

Затем, после того как каждая капля будет растирана, добавьте в каждую еще по 200 микролитров полной среды. Теперь пропустите клетки через сетчатый фильтр 40 микрон в новую лунку. В пределах той же шестилуночной пластины и затем перенести ячейки из каждой лунки в отдельные стандартные факсимильные трубки.

Затем добавьте по 100 микролитров клеток дикого типа в каждую из трех пробирок, после чего разведите 300 микролитрами полной среды только для CUG. Контроль разводят 10 микролитров аксона, две LAX Z ячейки в 390 микролитрах полной среды. Перенесите оставшиеся аксоны двух слабых Z-клеток в факсимильные трубки в 400 микролитровых ОТ.

Затем, после инкубации пробирок в увлажнённом инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, добавьте 200 микролитров разбавленного CUG в каждую подходящую факсимильную трубку. Далее, защитив все трубки от света, инкубируйте клетки в увлажнённом инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение 25 минут. Для окрашивания во время инкубации клеток поместите 10 миллилитров свежеприготовленных куч плюс FBS в 15-миллилитровую пробирку и поместите пробирку на лед.

Затем добавьте 1,8 миллилитра ледяного раствора в каждую из трубок факса под стерильным колпаком при выключенном свете, чтобы свести к минимуму воздействие света. Затем центрифугируйте ячейки при 1200 об/мин в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулы в 300 микролитрах полной среды.

Объедините все аликвоты для сортировки образца, а затем добавьте йодид пропидия в каждую подходящую пробирку до конечной концентрации один микрограмм на миллилитр. Наконец, накрыв ячейки, еще раз поместите их на лед. Настройте сортировочные ворота, сначала собрав 1000 событий неокрашенных ячеек дикого типа, чтобы определить распределение ячеек на прямой и боковой диаграмме рассеяния.

При необходимости отрегулируйте параметры разброса вперед и вбок. Затем компенсируют неокрашенным диким типом PI окрашенным диким типом и окрашенным аксоном CUG. Две Z-ячейки LAX.

Заполните две факсимильные трубки 500 микролитрами полного носителя. Затем начните анализ с окрашивания PI дикого типа и затвора с двумя аксонами Lae CUG, чтобы исключить мусор на основе графика прямого и бокового рассеяния. Исключите дублеты и скопления с помощью графика на основе зависимости высоты прямого рассеяния от области прямого рассеяния.

Затем исключите PI-положительные мертвые ячейки на основе области прямого рассеяния по сравнению с пятирайонным графиком PE sci. Для каждого расположения походки настройте график области разброса вперед против каскада или синей области Тихого океана. Проанализируйте 10 000 событий из пробирки образца сортировки, содержащей аксоны, два слабых окрашенных PI и CUG клеток, используя все вентили, установленные с ячейками дикого типа, используя графики из клеток дикого типа.

Создание вентилей для каскада синих высоких ячеек, которые составляют менее 1% от общего числа событий. Каскад Blue High Gates теперь должен содержать от 15 до 20% клеток в образце Axon two discy. Создание этих аксонов двух высоких клеток с использованием графика анализа двух слабых клеток Аксона теперь создает ворота для наименьшего гриппа, от 15 до 20% клеток, используя вышеупомянутую стратегию гейтирования.

Сортируйте ячейки по факсимильным трубкам, содержащим полный носитель, сохраняя коллекторные трубки в камере, охлажденной до четырех градусов Цельсия во время сортировки. Запишите количество клеток, подсчитанных проточным цитометром для каждой популяции, на этих двух рисунках. Боковые зоны рассеивания против передних областей разброса диссоциированного типа wild слева и аксона два LA Z справа.

Показаны кохлеарные клетки. Обратите внимание на стробирование отдельных групп событий гораздо большего размера, чем те, которые находятся ближе к оси Y, обозначенные как отрицательная популяция мусора. Как правило, от 40 до 45% свободных от мусора клеток восстанавливаются как из дикого типа, так и из аксина двух улиток LAX Z в этих двух панелях.

Высота прямого рассеяния по отношению к прямой области рассеивания используется для исключения дублетов из ранее закрытого мусора. Исключаются отрицательные популяционные события, отклоняющиеся от ожидаемого линейного характера графика. Эта подготовка обычно приводит к 71,1% событий в пределах назначенного вентиля. Здесь.

Йодид пропидия, обнаруженный пятиканальным методом PE SCI, используется для исключения мертвых клеток, наблюдаемых на этих диаграммах рассеяния. Около 95% отсортированных клеток были жизнеспособными и не поглощали PI PI в этих панелях. Синий канал Cascade был использован для обнаружения флуоресцентной подложки CUG, как видно на рисунке справа.

В среднем, верхние примерно 20% CUG-положительных клеток являются лэ-клетками, которые коррелируют примерно с 15 000 аксонов, двумя высокими клетками на 10-12 животных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как препарировать и изолировать слабые высокие клетки с помощью проточной цитометрии из тканей внутреннего уха как для экспериментов по Тьюрингу, так и для таких экспериментов, как профилирование генов.