RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс

Целью этой процедуры является идентификация постэмбриональных регуляторов экспрессии и локализации белка в C-элегантности с помощью геномного скрининга на основе РНК-интерференции и флуоресцентно меченных белков. После того, как соответствующий скрининговый штамм сконструирован, выбирается библиотека РНК-интерференции. Первым шагом процедуры является упаковка клонов библиотеки в бактерии.

Затем бактерии отбирают, выращивают и скармливают стадийным нематодам. После того, как нематоды растут в течение 72 часов, за ними наблюдают на предмет изменений в интересующем их фенотипе. В конечном счете, изменения в экспрессии или субклеточной локализации атакуемого белка визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии.

Этот метод позволяет идентифицировать гены, необходимые для правильной субклеточной локализации флуоресцентно меченного белка. Тем не менее, этот протокол может быть модифицирован для идентификации генов, влияющих на другие постэмбриональные фенотипы, представляющие интерес. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими опубликованными протоколами заключается в том, что мы оптимизировали согласованность и уровень ответа РНК-интерференции у животных путем индуцирования продукции двухцепочечной РНК у бактерий перед нанесением покрытия.

Демонстрация процедуры будет Кэти Фасс, научный сотрудник моей лаборатории В течение двух месяцев после начала эксперимента подготовьте библиотеку клонов для первых полос бактерий из выбранных клонов библиотеки, а также положительные и отрицательные контрольные группы на пластинах с углекислым тетрациклином LB. Для положительного контроля используйте клон, содержащий ген, который продуцирует дозозависимый постэмбриональный фенотип, такой как BLE 4. Для отрицательного контроля используйте пустой вектор или клон, содержащий предсказанный псевдоген без наблюдаемых фенотипов.

Инкубируйте планшеты в течение ночи, для каждого клона инокулируйте два миллилитра среды LB, содержащей 50 микрограммов на миллилитр. Угольную кислоту с одной колонией из прожилочных пластин, инкубируйте культуры в течение ночи с перемешиванием на следующее утро. Растворы должны быть индуцированы мутностью производства двухцепочечной РНК путем добавления IPTG к культурам и инкубации их в течение дополнительных четырех-пяти часов в тех же условиях.

Добавление IPTG обеспечивает более последовательный и надежный индуцированный РНКИ нокдаун генного продукта, чем использование только IPTG и шнека NGM-планшета После инкубации IPTG поместите 30 микролитров культуры от каждого клона в каждую лунку из подготовленных 24-луночных NGM РНК-интерференционных планшетов. Один клон на лунку. Каждая пластина должна иметь по две лунки, предназначенные для органов управления.

Тщательно определите местоположение каждой библиотеки. Клонируйте в 24 лунки планшеты, теперь поместите незакрытые пластины в стерильный проточный колпак для сушки примерно на 20 минут. Не допускайте, чтобы края агара отрывались от пластины.

После высушивания на стадии нематод до пластин дается инструкция по приготовлению нематоды. В следующем разделе мы начнем со стадийной популяции первой личиночной стадии или L-одной нематоды. Начиная с L, одна личинка обходит потенциальные эмбриональные летальные фенотипы.

Наличие поэтапной популяции животных для скрининга также повышает уверенность в том, что любые наблюдаемые изменения обусловлены РНК-интерференцией, а не просто нормальными вариациями, происходящими на разных стадиях. Однако, если РНК-интерференция вызывает задержку в развитии, это должно быть отмечено скринером Bleach. Популяция скринингового штамма на смешанной стадии.

Только эмбрионы, защищенные от яичной скорлупы, выживут на этом этапе животные в течение 12 часов, если проводить их при температуре 20 градусов Цельсия, или в течение 18 часов. При проведении при температуре 16 градусов Цельсия в день инокуляции бактериальных культур. Выберите три 100-миллиметровые пластины скринингового штамма животных, которые являются здоровыми и содержат как гравитацию, так и взрослые особи и эмбрионы.

Вымойте всех животных в стерильных М девяти средах и переложите промывку в стерильную 15-миллилитровую пробирку с завинчивающейся крышкой. Если объем стирки превышает 3,5 миллилитров, отжмите на животных и удалите все, кроме 3,5 миллилитров жидкости. Если меньше 3,5 миллилитров.

Увеличьте объем до 3,5 миллилитров с помощью воды или М девяти, чтобы освободить эмбрионы от взрослых особей по 1,5 миллилитра смеси гидроксида натрия и отбеливателя до каждой промывки. Дайте животным поинкубироваться не более 10 минут в этом растворе. Запустив таймер, закрутите каждую трубку на 10 секунд и повторяйте вихрь каждые две минуты.

После каждого вортекса наблюдайте за раствором под препарирующим эндоскопом для туш животных. В течение шести-восьми минут взрослые особи будут фрагментированы, и эмбрионы должны быть освобождены. Извлеките эмбрионы из раствора отбеливателя, гранулировав их и удалив как можно больше надосадочной жидкости, не нарушая гранулы.

Затем повторно суспендируйте гранулу в объеме 10 миллилитров, добавив стерильный М девять и используя перемешивание. Повторите этот процесс стирки по крайней мере еще один раз, пока запах отбеливателя не станет полностью неразличимым. Для более жесткой стадии животные останавливают их на стадии L, высиживая эмбрионы в среде М9 без пищи.

Это делается путем переноса эмбрионов из М девяти в небольшую колбу Эрленмейера. Встряхните колбу на ночь при температуре, подходящей для штамма, и поэкспериментируйте. За это время все животные вылупятся и задержатся в L на следующий день.

Возобновите рост личинок с заданного временного момента, перенеся их на подготовленные бактерии, экспрессирующие двухцепочечную РН. В тот же день 24 луночные пластины были замечены бактериями. Начните с того, что переложите животных в 15-миллилитровую трубку и раскрутите их вниз. Затем сконцентрируйте животных в одну половинку-один миллилитр М9 и поместите пять микролитров концентрированных нематод на тарелку.

Посчитайте количество животных на тарелке и отрегулируйте концентрированный раствор нематоды. TE 30 червей на каждые три-10 микролитров. Наконец, поместите около 30 л одностадийных животных на бактерии в каждой лунке приготовленного продукта.

После того, как пятна высохнут, на что уйдет несколько минут, закрепите крышку резиновой лентой, инкубируйте животных при необходимой температуре и продолжительности, чтобы забить животных на нужной стадии. Как только нематоды будут готовы к скринингу, подтвердите, что положительный и отрицательный контроль производят ожидаемые фенотипы. Затем понаблюдайте за подопытными животными на предмет аномалий развития.

Затем с помощью препарирующего микроскопа установите от восьми до 12 животных из каждой лунки на предметные стекла 4%Agri ПЭТ с каплей анестетика объемом 5 микролитров. После наложения соответствующего покровного стекла проведите наблюдения не менее чем за пятью животными с помощью комплексной микроскопии. Ведите организованную базу данных о гене, количестве наблюдаемых животных и фенотипических результатах.

Для каждого эксперимента с РНК проверяйте любой полученный фенотип R RNAi по другому вторичному фенотипу, если это возможно, и, повторяя эксперимент, повторите эксперимент, чтобы использовать бактерии из той же полосы. Более старые полосы могут привести к плохому росту жидких ночных культур, и их следует сначала перерасти. Некоторые бактериальные культуры не будут хорошо расти из-за генного продукта, экспрессируемого в их плазмиде.

В этом случае просто сконцентрируйте бактерии перед нанесением покрытия. Для непрерывного скрининга важно поддерживать большое количество эмбрионов, всегда готовых к стадии. Скрининговый штамм всегда следует кормить, не морить голодом и не содержать загрязняющих веществ, которые могут повлиять на интересующий его фенотип.

Мы установили график технического обслуживания для кормления животных. Гены, влияющие на локализацию DBL one, были идентифицированы с помощью РНК-интерференции с использованием дизайна штамма для этого скрининга. Нормальная экспрессия GFP-метки dbl включает в себя тела клеток вентрального нервного канатика и ряд животных puncti, которых кормили антисмысловым RA до DBL.

Одна мРНК показала сильно ослабленную экспрессию DBL. Эти животные также были маленькими, как и животные, у которых отсутствовал функциональный DBL L. Скрининг РНК I успешно идентифицировал многие другие гены, продукты которых влияют на локализацию DBL one, тем самым расширив наше понимание того, как TGF beta подвергается субклеточному трафику, и обеспечив отправную точку для многих других исследований.

Используя этот метод, один человек может разумно проводить и наблюдать за двумя-четырьмя сериями экспериментов каждую неделю. Например, за животными, поставленными в понедельник и вторник, можно наблюдать в четверг и пятницу соответственно, а за животными можно снова наблюдать в пятницу и субботу в понедельник и вторник. Наблюдение: Выполняя эту процедуру на экране.

Важно поддерживать достаточное количество эмбрионов, готовых к стадии, поэтому регулярно поддерживайте скрининговый штамм. Кроме того, важно делать подробные заметки обо всех наблюдениях.