Количественные и автоматизированных высокой пропускной генома RNAi экраны в С. Элеганс

Общая цель данной процедуры заключается в количественном анализе функции генов для изучения их взаимодействия в масштабе всего генома. Это достигается путем предварительного подавления экспрессии каждого гена с помощью РНК-интерференции в 96-луночных планшетах.

Затем проводится соответствующий тест на функцию гена. В данном примере способность sea elegance нормально реагировать на грибковую инфекцию оценивается путем анализа экспрессии индуцибельного флуоресцентного репортера. После этого выполняется автоматизированный количественный анализ с использованием Coss bio sortt; в конечном итоге анализ количественных признаков, таких как экспрессия флуоресцентного репортерного гена, выявляет подмножества генов, необходимых для модуляции конкретных путей, регулирующих развитие, поведение или физиологию.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в различных областях, где важна элегантность подхода, таких как развитие, нейробиология, а также взаимодействие хозяина с патогенами. Идея этого метода впервые возникла у нас после публикации первых крупномасштабных РНК-скринингов лаборатории Oranger. Потребовались значительные усилия для разработки необходимых инструментов и совершенствования автоматизации.

Я продемонстрирую эту процедуру вместе с Оливией, штатным ученым и научным сотрудником из лаборатории Джонатана Юбэнкса. Чтобы подготовить 10-12 планшетов на 96 лунок, начните с приготовления 100 миллилитров среды для выращивания нематод или NGM на деионизированной воде. Инструкции приведены в письменном протоколе.

Пока среда еще теплая, добавьте 100 µg/mL ампициллина, 12,5 µg/mL тетрациклина, 4 mM IPTG и быстро распределите по 75 µL в каждую лунку 96-луночного плоского планшета. Немедленно проверьте наличие пузырьков воздуха в лунках и удалите их. Храните планшеты во влажной камере при температуре 4 °C.

Затем подготовьте 96-луночные глубокие планшеты, добавив 1,5 milliliters среды LB, содержащей ампициллин и тетрациклин. Каждую лунку пометьте уникальным ярлыком или штрихкодом. Если планшеты подготовлены заранее, накройте их и храните при температуре four degrees centigrade; перемешайте 96-луночный стоковый планшет с LB, содержащий RNAI.

Подготовьте бактериальные клоны с ампициллином, тетрациклином и глицерином, затем распределите по 3 µL каждого бактериального клона в соответствующие лунки предварительно подготовленного глубокого 96-луночного планшета. Используйте пустые лунки для контролей; закройте глубокие 96-луночные планшеты адгезивной пленкой и инкубируйте их в течение ночи при 37 °C с перемешиванием. На следующее утро после ночного культивирования поместите использованный репликационный 96-луночный планшет при температуре -80 °C.

Перенесите 96-луночные планшеты с NGM из температуры 4 °C в стерильный ламинарный шкаф и дайте им прогреться и подсохнуть в течение 5–15 минут. Затем нанесите соответствующую маркировку или штрихкод на каждую планшету. Извлеките из инкубатора 96-луночные глубокие планшеты с ночными культурами.

Процентругируйте успешно выращенные бактериальные культуры в 96-луночных планшетах с глубокими лунками в течение пяти минут при 4 000 RPM. Слейте супернатант, резко перевернув планшет, и быстро просушите его.

Края планшета, находящегося на бумажном полотенце, позволяют ресуспендировать бактериальный осадок в остаточной жидкости при помощи вортекса. В идеале следует использовать специальный встряхиватель, чтобы каждый планшет подвергался точно одинаковой обработке. Перенесите 5 µL ресуспендированных бактерий на 96-луночные планшеты с NGM, используя 8- или 12-канальный многоканальный дозатор.

Избегайте прикосновения к NGM. Дайте бактериям высохнуть в стерильном ламинарном шкафу в течение примерно двух часов. Регулярно проверяя, чтобы NGM не пересохла, инкубируйте 96-луночные планшеты R-N-A-I-N-G-M при 37 °C в течение ночи во влажной камере.

Обратитесь к письменному протоколу для подготовки синхронизированной популяции червей после охлаждения 96-луночных планшетов R-N-A-I-N-G-M при комнатной температуре. Добавьте примерно от 100 до 200 червей в 2 µL среды M9 в каждую лунку. Убедитесь, что в каждой лунке есть черви.

Черви должны активно плавать. Дайте чашкам высохнуть в стерильном ламинарном шкафу в течение не более одного часа. Регулярно проверяйте состояние чашек.

Черви должны ползать, а не плавать. Поместите планшеты во влажную камеру при температуре 25 °C на ночь. После выбора высокоинфекционной партии спор Judge Miria.

Используйте буфер M9 для сбора спор с чашки диаметром 9 см. Внесите по 4 µL суспензии спор в каждую лунку и убедитесь в наличии спор в каждой из них. Черви должны активно плавать.

Оставьте чашки подсохнуть в стерильном ламинарном шкафу примерно на один час. Регулярно проверяйте чашки до тех пор, пока черви не начнут перемещаться. Затем поместите зараженные чашки во влажную камеру при температуре 25 °C на ночь.

Перед проведением анализа проверьте червей, быстро осмотрев их под флуоресцентным микроскопом, чтобы убедиться в их успешном развитии, наличии выраженной индукции GFP в лунках отрицательного контроля и снижении флуоресценции GFP в лунках положительного контроля. При удовлетворительной индукции перенесите червей с помощью 8- или 12-канального многоканального дозатора в новую маркированную или штрихкодированную 96-луночную планшетку с круглым дном, используя 100 µL 50 mM NaCl и 0,05% Triton.

Заморозьте планшеты при температуре −80 °C до момента проведения анализа. В день анализа разморозьте замороженные планшеты при комнатной температуре. После размораживания планшетов переходите к автоматизированному анализу с использованием системы COPA bios.

Аппарат Sortt обрабатывает планшет поочередно по каждой лунке и анализирует параметры каждой нематоды, такие как их флуоресценция. Перенесите информацию, полученную с помощью COPA bios sortt, в файл Excel для проверки качества данных. Затем сохраните необработанные данные, включая оптическую плотность, осевую длину и флуоресцентное излучение, в пакет limbs для последующего детального количественного анализа.

В данном эксперименте трансгенные черви конститутивно экспрессировали репортер P call 12 ds red и индуцибельный PNLP 29 GFP. Репортерные черви подвергались воздействию контрольного образца или клона A-G-F-P-R-N-A eye в течение 48 часов. Панели слева представляют неинфицированных червей, а панели справа — червей через 18 часов после инфицирования D spora.

Когда интересующим фенотипом является экспрессия репортера GFP, лунки с клоном GFP RNAi служат надежным контролем. COPA bios SORTT генерирует числовые данные для каждого проанализированного червя. На этих графиках показаны среднее значение и стандартное отклонение для каждой лунки с трансгенными червями.

Конститутивная экспрессия репортера p call 12 DS red и индуцибельного репортера PNLP 29 GFP после РНК-интерференции (RNAI) и заражения diaspora. Сортировщик анализирует время пролета (TOF), которое соответствует размеру червей, красную флуоресценцию и соотношение зеленой флуоресценции к TOF. Определенные клоны вызывают дефекты роста и/или влияют на экспрессию P 12 DS red.

Другие специфически влияют на экспрессию FP. Например, данный конкретный клон нацелен на ген NS Y, который ранее был признан важным для регуляции NLP 29. Зеленая и красная флуоресценция, а также TOF измеряются в произвольных, но постоянных единицах.

Одной из особенностей данного протокола является использование заморозки планшетов для отсрочки их анализа. Заморозка позволяет хранить планшеты до двух недель без существенного изменения результатов, как показано здесь. Хотя абсолютные значения измеренной флуоресценции могут измениться, их относительные соотношения остаются схожими.

Четыре группы червей, несущих трансгены PNLP 29 GFP и P call 12 ds red, были либо инфицированы диаспорой, либо нет. Через 18 часов каждую планшетку примерно разделили пополам: одну половину анализировали немедленно, а вторую замораживали при температуре минус 80 °C на 24 часа перед размораживанием. Для каждого образца были рассчитаны значения анализа среднего размера, опалесценции, а также зеленой и красной флуоресценции.

На графике показано отношение среднего значения для инфицированных образцов к среднему значению для неинфицированных образцов для представленных здесь замороженных и живых образцов. На основе дубликатных анализов репрезентативного планшета рассчитаны нормализованные коэффициенты флуоресценции для каждой лунки, которые представляют собой среднее значение флуоресценции в лунке, деленное на усеченное среднее значение по всему планшету. При должном освоении данный протокол позволит группе из двух или трех человек провести общегеномный скрининг за два-три месяца.

Успешное выполнение данного протокола требует слаженной командной работы. Члены моей группы приложили огромные усилия, чтобы создать эффективный и относительно простой в исполнении протокол.