Количественные и автоматизированных высокой пропускной генома RNAi экраны в С. Элеганс

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы количественно оценить функцию генов и увидеть элегантность в масштабах всего генома. Это достигается путем подавления экспрессии каждого гена с помощью РНК глаза. В 96 луночных планшетах.

Далее проводится соответствующий тест на функцию гена. В этом примере способность морской элегантности нормально реагировать на грибковую инфекцию оценивается путем анализа экспрессии индуцируемого флуоресцентного репортера. Затем выполняется автоматизированный количественный анализ с использованием биосортировки Coss, в конечном счете, анализ количественных признаков, таких как экспрессия гена флуоресцентного репортера, показывает подмножества генов, которые необходимы для модуляции определенных путей, управления развитием, поведением или физиологией.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в различных областях, которые вы считаете элегантными, таких как развитие, нейробиология, а также взаимодействие патогенов хозяина. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда в лаборатории Oranger были опубликованы первые крупномасштабные экраны РНК глаза. Потребовались значительные усилия для разработки необходимых инструментов и совершенствования автоматизации.

Я продемонстрирую эту процедуру вместе с Оливией Ти, штатным научным сотрудником и научным сотрудником из лаборатории Джонатана Юбэнкса. Колодцы планшетов начинают с подготовки 100 миллилитров нематоды для роста среды, или NGM в деионизированной воде. Пожалуйста, ознакомьтесь с письменным протоколом для получения инструкций.

Пока среда еще теплая, добавьте 100 микрограмм на миллилитр ампициллина, 12,5 микрограммов на миллилитр тетрациклина четырех миллимоляров ИПТГ и быстро распределите по 75 микролитров в каждую лунку 96-луночной пластины с плоским дном. Немедленно проверьте и удалите все пузырьки воздуха, присутствующие в лунках. Храните пластины во влажной камере при температуре четыре градуса по Цельсию.

Затем приготовьте 96 глубоких луночных пластин, добавив 1,5 миллилитров LB, содержащих ампициллин и тетрациклин. К каждой лунке добавьте уникальную этикетку или штрих-код. Накройте каждую пластину и храните при температуре четыре градуса по Цельсию, если это было приготовлено заранее, перемешайте 96-луночную пластину LB, содержащую RNAI.

Бактериальные клоны с ампициллином, тетрациклином и глицерином и распределяют по три микролитра каждого бактериального клона в соответствующую лунку предварительно подготовленной лунки глубиной 96 лунок. Используйте пустые лунки для контроля, накройте 96 глубоких лунок планшетами с клейкой пленкой и инкубируйте их на ночь при температуре 37 градусов по Цельсию с перемешиванием. Поместите использованную пластину 96 лунок для репликации при температуре минус 80 градусов Цельсия на утро после ночного посева.

Перенесите 96 луночных тарелок NGM с температурой четыре градуса Цельсия в стерильный ламинарный шкаф и дайте им прогреться и высохнуть в течение пяти-15 минут. Затем добавьте соответствующую этикетку или штрих-код на каждую пластину. Достаньте из инкубатора 96 глубоких луночных планшетов для ночных культур

Понаблюдайте за успешным выращиванием бактериальных культур на центрифуге. 96 глубоких лунок прокладывают в течение пяти минут при 4 000 об/мин. Слейте надосадочную жидкость, резко перевернув пластину вверх дном, и быстро высушите.

Краями пластины на бумажном полотенце ресуспендируют бактериальную гранулу в остаточной жидкости путем вортексирования. В идеале следует использовать специальную мешалку, чтобы каждая пластина получала точно такую же обработку. Перенесите пять микролитров взвешенных бактерий Resus на 96-луночные планшеты NGM с помощью восьми- или 12-канальной мультипипетки.

Избегайте прикосновения к NGM. Дайте бактериям высохнуть под стерильным ламинарным шкафом в течение примерно двух часов. Регулярно проверяя, чтобы избежать превращения NGM в сухую воду, 96 лунок R-N-A-I-N-G-M тарелки при температуре 37 градусов по Цельсию на ночь во влажной камере.

Обратитесь к письменному протоколу подготовки синхронизированной популяции червей после охлаждения 96 луночных пластин R-N-A-I-N-G-M при комнатной температуре. Добавьте примерно от 100 до 200 червей в двух микролитрах М девять к каждому. Хорошо проверьте, чтобы в каждой лунке были черви.

Черви должны плавать. Дайте планшетам высохнуть под стерильным ламинарным шкафом в течение максимум одного часа. Регулярно проверяйте таблички.

Черви должны ползать, а не плавать. Поместите пластины во влажную камеру при температуре 25 градусов по Цельсию на ночь. После отбора высокозаразной партии Judge Miria spora.

Используйте буфер M nine для сбора спор с девятисантиметровой пластины. Распределите по четыре микролитра спор в каждую лунку и проверьте каждую лунку на наличие спор. Черви должны плавать.

Поставьте пластины сушиться под стерильным ламинарным шкафом примерно на один час. Регулярно проверяйте пластины, пока черви не начнут ползать. Затем поместите зараженные пластины во влажную камеру при температуре 25 градусов по Цельсию на ночь.

Проверьте черви перед анализом, быстро наблюдая за ними под флуоресцентным микроскопом на предмет успешной разработки хорошей индукции GFP при отрицательном контроле и снижения флуоресценции GFP на положительных контрольных лунках. Если индукция хорошая, с помощью восьми- или 12-канальной мультипипетки перенесите червей со 100 микролитрами 50 миллимолярного NACL и 0,05% тритона на новую маркировку или штрих-код. 96 хорошо круглая нижняя пластина.

Заморозьте пластины при температуре минус 80 градусов Цельсия до анализа в день проведения анализа разморозьте замороженные пластины при комнатной температуре. Как только пластины оттают. Перейдите к автоматизированному анализу с помощью COPA bios.

Сортировочная машина хорошо обрабатывает пластину и анализирует параметры каждого шнека, такие как их флуоресценция. Расшифруйте информацию, полученную из COPA bios, отсортируйте в файл Excel для проверки качества данных. Затем сохраните необработанные данные, включая оптическую плотность, осевую длину и флуоресцентное излучение, в пакете конечностей для последующего подробного количественного анализа.

В этом эксперименте трансгенные черви конститутивно экспрессировали P call 12 ds red reporter и индуцируемый PNLP 29 GFP. Репортерные черви подвергались воздействию клена глаза A-G-F-P-R-N-A в течение 48 часов. Панели слева — это неинфицированные черви, а те, что справа, — черви через 18 часов после заражения D. spora.

Когда представляющий интерес фенотип является экспрессией репортера A GFP, ген Wells с клоном GFP RNAi обеспечивают надежный контроль. COPA bios SORTT генерирует числовые данные для каждого анализируемого червя. Эти графики показывают среднее и стандартное отклонение для каждой лунки трансгенных червей.

Конститутивно выражая p call 12 DS red reporter и индуцируемый PNLP 29 GFP reporter после RNAI и заражения диаспорой. Сортировщик анализирует время полета или TOF, которое соответствует размеру червей, красной флуоресценции и отношению зеленой флуоресценции к TOF. Некоторые клоны провоцируют дефекты роста и/или влияют на экспрессию красного цвета P 12 DS.

Другие специфически влияют на экспрессию FP. Например, этот конкретный клон нацелен на ген NS Y, который, как было показано ранее, важен для регуляции NLP 29. Зеленая и красная флуоресценция и TOF измеряются в произвольных, но постоянных единицах.

Одним из нововведений этого протокола является использование замораживающих пластин для отсрочки их анализа. Замораживание позволяет хранить пластины до двух недель без существенного изменения результатов, как показано здесь. Хотя абсолютные значения измеренной флуоресценции могут изменяться, их относительные отношения остаются одинаковыми.

Четыре черви, несущие трансгены PNLP 29 GFP и P call 12 ds red, были либо инфицированы диаспорой, либо нет. Через 18 часов каждая пластина была грубо разделена на две части, половина была проанализирована сразу, а половина была заморожена при температуре минус 80 градусов Цельсия в течение 24 часов перед размораживанием. Для каждого образца были рассчитаны значения средней непрозрачности размера и зеленой и красной флуоресценции.

На графике показано соотношение среднего числа инфицированных и неинфицированных образцов для замороженных и живых образцов, показанных здесь. Из повторных анализов репрезентативной пластины получаются нормализованные коэффициенты флуоресценции для каждой лунки, которые представляют собой среднее значение флуоресценции лунки, деленное на усеченное среднее значение пластины. После освоения этот протокол может позволить группе из двух-трех человек провести полногеномный скрининг за два-три месяца.

Успешное выполнение этого протокола требует большой командной работы. Члены моей группы приложили огромные усилия, чтобы сделать протокол эффективным и относительно простым в выполнении.