Высокая Скрининг Содержание в нейродегенеративных заболеваний

Общая цель следующего эксперимента заключается в использовании высокопроизводительных анализов (high content assays) на клеточных моделях заболеваний для количественной оценки путей, затронутых при нейродегенеративных заболеваниях. Для достижения этой цели клеточная модель фенотипа заболевания помещается в автоматизированную систему культивирования клеток, и клетки инкубируют до достижения необходимого количества. Затем клетки разделяют, подсчитывают и распределяют по 96-луночным планшетам, содержащим лентивирус, экспрессирующий различные shRNA.

После шести дней дифференцировки клеток их извлекают из системы для иммуноокрашивания и высокопроизводительного имиджинга. В завершение изображения анализируются с помощью различных алгоритмов анализа для количественной оценки показателей, связанных со здоровьем клеток: нейронального роста и функцией митохондрий.

Результаты также анализируют с помощью двухфакторного анализа в программе Novas для выявления значимых эффектов взаимодействия. Этот метод позволяет быстрее ответить на ключевые вопросы о функциях генов, связанных с заболеванием, и путях, в которых они в целом функционируют. Это, в свою очередь, приведет к лучшему пониманию патогенных механизмов, участвующих в развитии нейродегенеративных заболеваний.

Для начала процесса культивирования клеток подготовьте автоматизированную систему культивирования клеток для ввода планшетов с культурами клеток. Загрузите в систему расходные материалы, такие как наконечники для дозаторов, планшеты для культивирования клеток и анализа. Также убедитесь, что в системе вручную добавлен достаточный объем среды для культивирования клеток, PBS и трипсина.

Посейте в две планшеты omni tray по 2 × 10⁶ клеток каждой линии нейробластомы SH SY five Y. Культивируйте клетки в оптимальной среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки FBS. Поместите планшеты на входную полку робота для культивирования клеток. С помощью графического интерфейса пользователя (GUI) выберите протокол для адгезивных культур клеток и настройте файлы параметров, специфичные для данной адгезивной линии, так, чтобы порог конфлюэнтности был установлен на уровне 70%.

Общее время ионизации составляет две минуты. Дайте системе команду подготовить новые планшеты Omni tray с плотностью посева 2 × 10⁶ клеток на планшет. Дайте системе команду подготовить четыре анализа на один планшет Omni tray с общим количеством 5 000 клеток на лунку; инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2.

Данный протокол адгезивного культивирования клеток включает следующие этапы. Пластины инкубируют и подвергают визуализации до тех пор, пока клетки не достигнут заданного порога конфлюэнтности. Если клетки не достигают этого порога в течение пяти циклов считывания, пластины извлекают из системы.

При достижении заданного пользователем порога конфлюэнтности клетки промывают, трипсинизируют и подсчитывают. Предопределенное количество клеток переносят на новые планшеты OmniTrait, и при наличии достаточного числа клеток заданное количество assay-планшетов перемещается на рабочую платформу, после чего в каждую лунку дозируется определенное количество клеток. Наконец, assay-планшеты можно подвергнуть прямому визуализированию с помощью встроенного микроскопа или выгрузить из системы для дальнейшей обработки с целью начала процедуры получения вируса.

Инокулируйте среду LB с ампициллином бактериальными глицериновыми стоками, содержащими векторы HRNA, и культивируйте их в течение ночи. На следующий день центрифугируйте клетки и удалите супернатант; выделите плазмиды с помощью системы очистки плазмидной ДНК из клеток Wizard Magnus. Конечный элюат, содержащий плазмидную ДНК, собирают в 96-луночные планшеты. Лентивирус S-H-R-N-A производят с использованием системы RNAi consortium для производства лентивируса в 96-луночных планшетах. Все эксперименты должны проводиться в лаборатории уровня биологической безопасности ML2 или BSL2, а все использованные реагенты и расходные материалы должны быть подвергнуты деконтаминации 30% раствором хлора после использования.

Процедура получения лентивируса не будет продемонстрирована в данном видео, однако она занимает четыре дня и состоит из следующих этапов. Сначала, в день 0, проводится посев упаковочных клеток. На следующий день, в день 1, через 18 часов после трансфекции упаковочные клетки трансфецируют тремя плазмидами лентивируса.

На второй день среду заменяют на свежую среду с высоким содержанием BSA или сыворотки. Через 24 часа после смены среды, на третий день, собирают вирус и повторно заменяют среду на свежую среду с высоким содержанием BSA или сыворотки.

Наконец, через 24 часа после первого сбора вируса, на четвертый день, вирус собирают повторно, а упаковочные клетки утилизируют для расчета кратности заражения или MOI лентивируса. Трансдуцируют клетки SHSY 5Y серийными разведениями вируса, инкубируя клетки при 37 °C в течение 72 часов после трансдукции. Визуализируют экспрессию GFP под микроскопом и определяют процент GFP-положительных клеток. Высевают лентивирус shRNA на планшеты для анализа с MOI, равным 3. После высева лентивируса shRNA на планшеты для анализа загружают их в автоматизированную систему культивирования клеток для лентивирусной трансдукции.

Через 24 часа среду в планшетах для анализа заменили на оптимальную среду, содержащую 0.5% FBS и 0.1 µM ретиноевой кислоты. Чтобы начать процесс дифференцировки, продолжали инкубацию планшетов для анализа в дифференцировочной среде в течение пяти дней для обеспечения максимального нокдауна экспрессии целевого гена. На пятый день в половину планшетов для анализа добавили H2O на 24 часа, чтобы стимулировать транслокацию белка DJ-1 в митохондрии. На шестой день в каждую лунку с клетками добавили Mitotracker до конечной концентрации 200 nM и инкубировали при 37 °C в течение 30 минут.

После этого планшеты можно перенести на сканер для высококонтентного анализа (HC-имиджер) для получения изображений. В качестве альтернативы планшеты можно извлечь из системы для дальнейшей обработки, например, для иммуноокрашивания. При высококонтентной визуализации в каждой лунке будет запечатлено в общей сложности 30 полей зрения с использованием объектива 20x: визуализация DJ1 с набором фильтров Trixy для митохондрий, с набором фильтров Trixy для бета-III-тубулина с набором фильтров S5 и ядер с набором фильтров UV.

Это пример композитных изображений клеток, полученных с помощью высокопроизводительного имиджинга. На рисунке три в панели A показаны необработанные клетки, а в панели B — клетки, обработанные H2O two. DJ one окрашены зеленым, митохондрии — красным, а ядра — синим. Чтобы определить средний коэффициент перекрытия между DJ one и митохондриями, проанализируйте изображения с помощью приложения Colocalization Bio.

Определите области интереса. ROI следующие: ROIA — ядро, рисунок 4 A и E, и ROIB — митохондрии, рисунок 4 B и F; исключите ROIA из ROIB. Чтобы обеспечить анализ только цитоплазмы, определите митохондрии как целевую область 1, а DJ 1 как целевую область 2, рисунок 4 C и G. Проанализируйте изображения с помощью биоприложения для компартментального анализа, чтобы определить среднюю интенсивность сигнала MIT tracker внутри митохондрий.

Рисунки 4 B и F демонстрируют среднюю длину нейритов по результатам окрашивания на бета-III-тубулин. Проанализируйте изображения с помощью биоприложения Neuronal Profiling (рисунки 4 D и H), используя автоматический конфокальный сканер Opera LX для считывания планшетов с изображениями.

Визуализируйте митохондрии с помощью лазера с длиной волны 561 нм, а ядра — с помощью изображения с УФ-возбуждением. Всего было исследовано 30 полей на лунку с использованием объектива 60x с иммерсией в воду. В завершение проанализируйте изображения с помощью алгоритма текстурных признаков spot edge ridge (SER).

Фильтр гребней SER пропускает интенсивность пикселей, образующих структуры, подобные гребням. Чем сильнее фрагментированы митохондрии, тем выше показатель SER ridge score. В данном видео использовались методы высокопроизводительного анализа (HC-анализы) для поиска модуляторов белка DJ-1, потеря которого вызывает аутосомно-рецессивный паркинсонизм.

Этот первый репрезентативный результат иллюстрирует эпистатическое взаимодействие с DJ one. Столбчатая диаграмма слева отображает нормированные единицы флуоресценции, а изображения справа показывают клетки SHSY five Y, окрашенные красным с помощью mito tracker для количественного определения жизнеспособности клеток.

Было замечено, что нокдаун DJ one в клетках, подвергнутых воздействию токсина, приводил к более выраженной потере жизнеспособности клеток по сравнению с клетками, инфицированными контрольным (scrambled) лентивирусом. Нокдаун целевого гена A оказал эффект, аналогичный тому, что наблюдался в клетках с нокдауном DJ one. Однако нокдаун как DJ one, так и целевого гена A приводил к значительно более сильной потере жизнеспособности клеток, чем потеря любого из этих генов по отдельности, что указывает на эпистатическое взаимодействие между DJ one и целевым геном A. Следующий пример касается гена, регулирующего транслокацию DJ one.

Столбчатая диаграмма показывает нормализованный коэффициент перекрытия между DJ one и митохондриями, что отражает транслокацию DJ one из цитоплазмы в митохондрии. Панели A–D представляют собой изображения клеток SHSY five Y, где зеленым цветом обозначен DJ one, красным — митохондрии, а синим — ядра. При воздействии токсина на клетки DJ one перемещается из цитоплазмы в митохондрии, что количественно выражается более высоким коэффициентом перекрытия между DJ one и митохондриями.

В клетках с менее выраженным сайленсингом целевого гена B белок DJ one перемещается в митохондрии при воздействии токсина; это позволяет предположить, что целевой ген B участвует в транспорте DJ one в митохондрии. Здесь представлен пример гена, участвующего в росте нейритов. Нормализованная длина нейритов представлена на столбчатой диаграмме, а клетки, использованные для количественного определения длины нейритов, показаны на изображениях, где бета-III-тубулин окрашен в зеленый цвет, а ядра — в синий.

Нокдаун целевого гена C в клетках SHSY five Y дикого типа приводит к значительному увеличению длины нейритов по сравнению с клетками, инфицированными лентивирусом, экспрессирующим скремблированную shRNA. Этот эффект нивелируется в клетках, инкубированных с токсином. Наконец, данные результаты демонстрируют пример гена, участвующего в формировании морфологии митохондрий.

На графике представлены средние значения сегментации гребней митохондриального SER для клеток SHSY five Y, инфицированных скрэмблированной HRNA или A-S-H-R-N-A, нацеленной на ген D. Изображение A и изображение C представляют собой композитные изображения клеток SHSY five Y, инфицированных скрэмблированной HRNA или A-H-R-N-A, нацеленной на ген D, соответственно. Митохондрии окрашены в красный цвет, а ядра — в синий.

Изображения B и D представляют собой визуализацию количественной оценки гребней SER, как показано здесь. Инфицирование клеток SHSY five Y дикого типа hRNA, нацеленной на ген D, приводит к увеличению значения сегментации митохондриальных гребней SER по сравнению с клетками, инфицированными контрольным (scrambled) лентивирусом. Данный подход может открыть исследователям в области нейродегенерации путь к своевременному изучению и аннотированию путей, участвующих в патогенезе заболевания.

Это в дальнейшем позволит определить более эффективные мишени для разработки терапевтических методов.