Электрическое поле контролируемых Режиссер миграции нервных клеток предшественников в 2D и 3D среде

Общая цель данной процедуры заключается в регистрации влияния приложенных электрических полей на миграцию нейральных клеток-предшественников в 2D-культурах и 3D-моделях ex vivo. Для этого сначала проводят выделение и экспансию нейральных клеток-предшественников in vitro. На втором этапе подготавливают суспензию одноклеточных нейральных клеток-предшественников.

Затем, для подготовки 2D-культуры, нейральные клетки-предшественники высевают в специально сконструированные электротактические камеры. В качестве альтернативы, для подготовки 3D-модели ex vivo, нейральные клетки-предшественники маркируют Hook3, 3, 3, 4, 2 и вводят в органотипическую модель среза спинного мозга. В завершение к электрокамерам прикладывают электрическое поле и проводят тайм-лапс запись, чтобы продемонстрировать, что клетки-предшественники мигрируют к катоду электрического поля как в 2D, так и в 3D средах.

Основным преимуществом данного метода является то, что он предоставляет новый способ отслеживания в режиме реального времени миграции отдельных клеток, индуцированной электрическим полем, после их трансплантации в 3D-органотипическую модель, которая максимально приближена к естественной среде. Этот метод позволяет не только изучить особенности электротаксиса и миграции нейрональных клеток, трансплантированных в срез спинного мозга, но также может быть применен и к другим системам, таким как модели срезов мозга. Для начала данной процедуры подготовьте стеклянные полоски размером 22 на 11 мм, разделив автоклавированный квадрат размером 22 на 22 мм.

Разрежьте покровные стекла номер один пополам с помощью алмазного резца. Затем создайте отдельную стеклянную лунку с внутренними размерами 22 на 10 мм, склеив четыре вертикально стоящие полоски размером 22 на 11 мм с помощью высоковакуумной силиконовой смазки; дайте лунке полностью высохнуть и затвердеть в течение ночи. На следующий день прикрепите две стеклянные полоски размером 22 на 11 мм параллельно друг другу с зазором 10 мм к дну чашки для культивирования диаметром 100 мм, используя силиконовую смазку.

Затем герметизируйте область между этими полосками, прикрепив покровное стекло размером 22 на 22 миллиметра с помощью силиконовой смазки. Установите стеклянную лунку на покровные стекла так, чтобы внутренние стенки образовали замкнутое пространство для посева клеток. Герметизируйте все стыки силиконовой смазкой.

Последовательно покройте эту ограниченную область полилизином, а затем ламинином, как описано в сопроводительной рукописи. В ходе данной процедуры извлеките головной мозг мышей на стадиях от E 14 до E 16 и поместите его в холодную базальную среду D-M-E-M-F 12. Затем удалите мозговые оболочки под анатомическим микроскопом.

После этого перенесите головной мозг в чашку Петри диаметром 35 мм. С помощью тонкого пинцета разделите ткани мозга на фрагменты. Затем перенесите их в центрифужную пробирку объемом 15 мл.

Образцы центрифугируют при 800 RPM в течение трех минут для удаления клеточного дебриса. Затем в образцы добавляют среду A-D-M-E-M-F 12, содержащую BFDF и DGF. Смешивают их с помощью одного миллилитрового дозатора.

Затем с помощью фильтра для клеток получите суспензию одиночных клеток. Рассейте клетки по флаконам в концентрации от 20 000 до 50 000 клеток на миллилитр. После этого каждые три дня проводите полную замену среды, что включает центрифугирование клеток при 1 300 RPM в течение пяти минут.

Удалите супернатант, перенесите нейросферы в свежую среду и верните клетки в колбу каждые шесть дней на протяжении как минимум пяти таких циклов. Перенесите нейросферы в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 1 500 об/мин в течение пяти минут. Удалите супернатант.

Ресуспендируйте осадок в ТЕS-EDTA до получения суспензии одиночных клеток. Перед проведением подсчета клеток подготовьте один миллилитр суспензии, содержащей 10 000 клеток. Затем удалите ламинин из стеклянной лунки и дайте ей полностью высохнуть.

Замените его одним миллилитром суспензии клеток. После этого поместите чашку в инкубатор при 37 °C минимум на четыре часа для обеспечения адгезии. Когда клетки достигнут достаточной конфлюэнтности, удалите среду из камеры.

Осторожно удалите стекло. Затем сформируйте «крышу» над клетками, аккуратно закрепив автоклавированное покровное стекло размером 22 by 22 millimeter между двумя полосками размером 22 by 11 millimeter с помощью силиконовой смазки. Не забудьте добавить несколько капель среды на клетки, чтобы предотвратить их высыхание.

Затем создайте изолированные резервуары с питательной средой на каждом конце камеры, сформировав два водонепроницаемых барьера из силиконовой смазки, проходящих от одного края чашки к другому. Заполните камеру свежей средой, обеспечив ее перетекание из одного резервуара в другой. После этого верните чашку в инкубатор на 12 часов для восстановления клеток.

На следующем этапе подготовьте крышку для чашки, просверлив в ней два отверстия — по одному над каждым резервуаром миграционной камеры. Затем замените среду в камере на культуральную среду, содержащую 25 миллимолярный буфер HEPES. После этого перенесите чашку в систему визуализации с контролируемой температурой.

Установите экспериментальные параметры для таймлапс-съемки и многопозиционной записи. Расположите камеру так, чтобы катод и анод находились слева и справа соответственно; это необходимо для того, чтобы вектор электрического поля был направлен горизонтально при просмотре в микроскоп и записи в системе визуализации. Затем наполните два стакана.

С использованием раствора Штайнберга. Соедините каждый резервуар с питательной средой с отдельным стаканом с помощью заранее подготовленных стеклянных мостиков, заполненных 2% раствором агара Штайнберга. Затем поместите серебряные электроды, подключенные к источнику питания постоянного тока, в раствор Штайнберга.

В каждом стакане установите регулятор напряжения на источнике питания в нулевое положение и включите его. Измеряя напряжение на электродективной камере с помощью вольтметра, постепенно поворачивайте регулятор напряжения. Затем отрегулируйте напряжение в соответствии с требованиями эксперимента.

После этого начните запись в режиме тайм-лапс. Произведите замену среды и при необходимости отрегулируйте напряжение. Каждый час в резервуары можно добавлять свежую среду, лекарственные препараты или химические агенты по мере необходимости.

Используйте дополнительные отверстия, просверленные в крышке чашки для культивирования, по одному над каждым резервуаром со средой. На данном этапе препарируйте поясничные отделы спинного мозга мышей в возрасте двух недель. Затем с помощью прецизионного томиграфа Machel-Wane под анатомическим микроскопом нарежьте спинной мозг на срезы толщиной 500 micron.

Разделите срезы и выберите те, в которых сохранена целостность структуры спинного мозга в сагиттальной и аксиальной плоскостях. Затем поместите срезы в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 30 µL MA-геля. Расположите их как можно ближе к центру.

Выдержите их в инкубаторе с 5% carbon dioxide при 37 °C не менее 30 минут. Для самосборки белков Matrigel с целью формирования тонкой пленки, покрывающей поверхность срезов спинного мозга, крайне важно, чтобы Matrigel полностью полимеризовался. При необходимости инкубируйте чашку Петри при 37 °C еще 30 минут, затем добавьте от 4 до 6 мл среды DMEM/F12, содержащей 25 мМ HEPES-буфера и 15–20% fetal calf serum.

Очень осторожно, чтобы избежать прямого попадания среды на срезы, убедитесь, что срезы не погружены в среду полностью и поверхность баклажанов хорошо открыта для доступа воздуха. Меняйте среду дважды в неделю. Теперь инкубируйте суспензию нейральных клеток-предшественников в среде с пятью микромолярными hook.

3, 3, 3, 4, 2 в течение 30 минут. Под микроскопом с помощью стеклянного капилляра введите две микролитры суспензии в срез спинного мозга методом микроинъекции. Медленно убедитесь, что стеклянный капилляр проходит через матригель и достигает внутренней части среза спинного мозга.

Оставьте стеклянную трубку внутри среза спинного мозга не менее чем на 30 секунд, чтобы избежать взвеси клеток. После этого поместите чашку Петри со срезом спинного мозга в инкубатор при температуре 37 °C и содержании CO2 5 % на ночь. На следующий день сконструируйте вокруг среза спинного мозга электротактическую камеру, содержащую крючки 3 3 3 4 2 с помеченными нейрогенетическими клетками, перед подачей электрического поля напряженностью 500 мВ/мм.

Здесь нейральные клетки-предшественники демонстрируют высоконаправленную миграцию к катоду при воздействии электрических полей; красные линии и синие стрелки представляют траектории и направление движения клеток соответственно. А здесь представлен график показанных путей миграции. Здесь нейральные клетки-предшественники помечены маркерами 3 3, 3, 4 2.

Их пересаживали в органотипический срез спинного мозга в начале воздействия электрического поля. После того как нейральные клетки-предшественники направленно мигрировали к катоду в течение 2,5 часов, полярность электрического поля была изменена на противоположную. Смена полярности электрического поля вызвала резкий разворот аксонов в сторону нового катода.

На данном изображении представлены трансплантированные нейральные клетки-предшественники в срезе спинного мозга. В конце записи таймлапса показана 3D-реконструкция трансплантированных нейральных клеток-предшественников в срезе спинного мозга. Масштаб установлен.

Данная методика может быть реализована за две недели при условии правильного выполнения после ее разработки. Этот метод открывает перед исследователями в области клеточной биологии возможности по изучению миграции нейральных прогениторных клеток в культурах 2D и 3D в ответ на воздействие электрического поля.