Электрическое поле контролируемых Режиссер миграции нервных клеток предшественников в 2D и 3D среде

Общая цель этой процедуры — зарегистрировать влияние приложенных электрических полей на миграцию нейронных клеток-предшественников в 2D-культуре и 3D-моделях ex vivo. Это достигается путем выделения и расширения нейронных клеток-предшественников in vitro. Второй шаг заключается в приготовлении одноклеточной суспензии из нейральных клеток-предшественников.

Затем, для подготовки 2D-культур, нейронные клетки-предшественники помещаются в специально разработанные электротактические камеры. В качестве альтернативы, для получения 3D-модели ex vivo нейральные клетки-предшественники помечаются крючками 3, 3, 3, 4, 2 и вводятся в органотипическую модель среза спинного мозга. В конечном счете, к электрокамерам прикладывается электрическое поле, и выполняется покадровая запись, чтобы показать, что клетки-предшественники мигрируют к катоду электрического поля как в 2D, так и в 3D-средах.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает новый метод отслеживания в реальном времени индуцированной электрическим полем миграции отдельных клеток после трансплантации в 3D-органотипическую модель, очень напоминающую природную среду. Этот метод может не только обеспечить внедрение в электротехнику миграции нейроэнтальных клеток, трансплантированных в срез спинного мозга, но и может быть применен к другим системам, которые в качестве срезов мозга моделируют небольшие размеры. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте полосы стекла 22 на 11 миллиметров, разделив автоклав 22 на 22 миллиметра.

Толщина покрытия номер один смещается пополам с помощью алмазной ручки. Далее создайте отдельно стоящий стеклянный колодец внутренних размеров, 22 на 10 миллиметров путем склеивания четырех вертикально стоящих полос 22 на 11 миллиметров вместе с высоковакуумной силиконовой смазкой, дайте колодцу полностью высохнуть и затвердеть за ночь. На следующий день прикрепите 2 стеклянные полоски размером 22 на 11 миллиметров параллельно друг другу, оставив зазор в 10 миллиметров к основанию 100-миллиметровой чашки для культур с помощью силиконовой смазки.

Затем загерметизируйте область между этими полосками, прикрепив защитное стекло размером 22 на 22 миллиметра с силиконовой смазкой. Хорошо поместите стекло на крышку так, чтобы внутренние стенки создавали ограниченное пространство для засеивания ячеек. Водонепроницаемые швы с помощью силиконовой смазки.

Покройте эту ограниченную область последовательно поли де лицином, а затем ламинином, как описано в сопроводительной рукописи. В ходе этой процедуры получают мозги от Е 14 до Е 16 мышей и помещают их в холодную базальную среду D-M-E-M-F 12. Далее удаляют мозговые оболочки под анатомическим микроскопом.

После этого перенесите мозги в 35-миллиметровую чашку Петри. С помощью тонких щипцов диссоциируйте мозг на фрагменты ткани. Затем переложите их в центрифугу объемом 15 миллилитров

Образцы при 800 об/мин в течение трех минут удаляют D-мусор. Далее A-D-M-E-M-F 12, содержащий BFDF и DGF, к образцам. Тритрат ел их с помощью пипетки объемом в один миллилитр.

Затем получите одноклеточную суспензию с клеточным фильтром. Поместите клетки в колбы в концентрации от 20 000 до 50 000 клеток на миллилитр. Затем выполняйте полную смену среды каждые три дня, что включает в себя центрифугирование элементов со скоростью 1300 об/мин в течение пяти минут.

Отбрасывание супината Resus, суспендирование PT в свежей среде и возвращение клеток в колбу каждые шесть дней по крайней мере после пяти дней. Перенесите NEUROSPHERES в центрифугу объемом 15 миллилитров со скоростью 1500 об/мин на пять минут. Выбросьте супинат.

Повторно суспендируйте гранулу в поездках в ЭДТА для получения одноклеточной суспензии. Перед проведением подсчета клеток приготовьте один миллилитр суспензии, содержащей 10 000 клеток. Далее хорошо удалите ламинин со стекла и дайте ему полностью высохнуть.

Замените его одним миллилитром клеточной суспензии. После этого поместите чашку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия минимум на четыре часа, чтобы обеспечить насадки. Как только клетки достаточно слягутся, удалите среду из камеры.

Осторожно снимите стекло. Ну а затем сформируйте крышу над клетками, аккуратно прикрепив автоклав 22 на 22 миллиметра стеклянной крышкой, проложите между собой 2 полоски 22 на 11 миллиметров силиконовой смазкой. Не забудьте покрыть ячейки несколькими каплями среды, чтобы избежать пересыхания.

Затем сформируйте изолированный резервуар для среды на каждом конце камеры, создав два водонепроницаемых барьера из силиконовой смазки, которые проходят от одного конца чашки к другому. Наполните камеру свежей средой, обеспечив протекание от одного резервуара среды к другому. После этого верните чашку в инкубатор на 12 часов, чтобы дать возможность восстановить клетки.

На следующем этапе подготовьте крышку для крышки чашки, просверлив два отверстия, по одному над каждым резервуаром миграционной камеры. Затем замените среду в камере на культивированную среду, содержащую 25-миллиметровый буфер хиппи. После этого переведите блюдо в систему визуализации с регулируемой температурой.

Задайте экспериментальные параметры для покадровой и многопозиционной записи. Выровняйте камеру так, чтобы катод и анод находились слева и справа соответственно, чтобы вектор электрического поля шел горизонтально, как видно под микроскопом и регистрируется в системе визуализации. Далее наполните два стакана.

С помощью решения Штейнберга. К каждому резервуару среднего размера подключите отдельный стакан с помощью заранее подготовленных стеклянных мостиков, заполненных 2%-ным раствором агара Штейнберга. Затем поместите серебряные электроды, подключенные к источнику питания постоянного тока, в раствор Штейнберга.

В каждой мензурке установите регулятор напряжения на блоке питания на ноль и включите его. Измерьте напряжение в электротактической камере с помощью измерителя напряжения, поворачивая регулятор напряжения вверх. Затем отрегулируйте напряжение в соответствии с требованиями эксперимента.

После этого запустите покадровую запись. Выполните смену среды и при необходимости отрегулируйте напряжение. Каждый час в резервуары могут добавляться свежие, средние препараты или химические реагенты по мере необходимости.

С помощью дополнительных отверстий просверливают в крышке чашки для культивирования, по одному над каждым средним резервуаром. На этом этапе рассеките поясничный отдел спинного мозга двухнедельных мышей. Затем разрежьте спинной мозг на участки толщиной 500 микрон с помощью измельчителя обзола машела под анатомическим микроскопом.

Отделите срезы и выберите те, у которых неповрежденная сагиттальная аксиальная структура спинного мозга. Далее выложите ломтики в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 30 микролитров геля MA. Расположите их как можно ближе к центру.

Выдерживайте их в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия не менее 30 минут. Чтобы белки геля матри самособирались, образовывали тонкую пленку, покрывающую поверхность срезов спинного мозга, очень важно, чтобы гель матри был собран полностью. При необходимости инкубируйте чашку Петри при температуре 37 градусов Цельсия еще 30 минут, затем добавьте от четырех до шести миллилитров среды D-M-E-M-F 12, содержащей 25 миллимоляров буфера heis, и от 15 до 20% эмбриональной телячьей сыворотки.

Очень осторожно, чтобы избежать попадания среды непосредственно на ломтики, убедитесь, что ломтики не полностью погружены в среду, оставляя поверхность баклажанов хорошо открытой для воздуха. Меняйте среду два раза в неделю. Теперь инкубируйте суспензию нейральных клеток-предшественников в среде с пятью микромолярными крючками.

3, 3, 3, 4, 2 по 30 минут. Под микроскопом используйте капиллярную стеклянную трубку, чтобы ввести два микролитра суспензии в срез спинного мозга. Медленно следите за тем, чтобы капиллярная стеклянная трубка прошла через матригелю и достигла внутренней части среза спинного мозга.

Держите стеклянную трубку внутри среза спинного мозга не менее 30 секунд, чтобы избежать взвешивания клеток. Пробегите, затем поместите чашку Петри, содержащую срез спинного мозга, в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5 центами углекислого газа на ночь. На следующий день соорудите электротактическую камеру вокруг среза спинного мозга, содержащую крючки 3 3 3 4 2 меченых клеток нейрогенеза, а затем подайте на него электрическое поле с напряжением 500 милливольт на миллиметр.

Здесь нейронные клетки-предшественники демонстрируют сильно направленную миграцию к катоду под воздействием электрических полей, красные линии и синие стрелки представляют траектории и направление движения клеток соответственно. А вот показан график путей миграции. Здесь представлены нейронные клетки-предшественники, помеченные крючками 3, 3, 3, 4, 2.

Они были пересажены в органотипический срез спинного мозга в начальной точке лечения электрическим полем. После того, как нейронные клетки-предшественники мигрировали в направлении к катоду в течение 2,5 часов, полярность электрического поля менялась на противоположную. Изменение полярности электрического поля вызвало резкое разворот axxis в сторону нового катода.

Вот изображение трансплантированных нейронных клеток-предшественников в срезе спинного мозга. В конце покадровой съемки показана 3D-реконструкция трансплантированных нейронных клеток-предшественников в пределах среза спинного мозга. Массовое освоение.

Эту методику можно сделать за две недели, если она выполнена правильно после ее освоения. Этот метод в настоящее время прокладывает путь исследователям в области клеточной биологии к изучению миграции нейронных прогенных клеток в системах 2D и 3D культур в ответ и применении к электрическому полю.