Пресинаптических Динамика Допамин в стриатуме мозга Ломтики с быстрой разверткой циклической вольтамперометрии

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать общий протокол для проведения быстрого циклического сканирования V-телеметрии срезов. Для этого сначала подготавливают ткани головного мозга для коронального срезания, после чего электроды помещают в конкретную исследуемую область мозга.

Следующим шагом является подача напряжения в виде треугольного сигнала через электрод для детектирования дофамина. В завершение на срез мозга наносят интересующий фармакологический агент и наблюдают за его влиянием на пресинаптическую динамику дофамина. В конечном итоге данный протокол позволяет выявить изменения в пресинаптической динамике дофамина, такие как стимулированный выброс дофамина и скорость захвата дофамина, с помощью быстросканирующей циклической вольтамперометрии.

Хотя данный метод позволяет изучить динамику дофамина в пресинаптических терминалях, его можно применять и к другим системам, включая других животных и нейромедиаторы, например, крыс и плодовых мушек, а также серотонин и норадреналин соответственно. Процедуру продемонстрируют Франсис Мена, MEA Халид и Эрин Оо, аспиранты моей лаборатории. Для начала процедуры, согласно прилагаемой рукописи, приготовьте три типа растворов искусственной спинномозговой жидкости: сахарозный A-C-S-F, раствор A-C-S-F для вольтамперометрической записи и модифицированный раствор A-C-S-F для калибровки электродов. Затем перенесите 10 мл сахарозного A-C-S-F в небольшой стакан и поместите его в ведерко со льдом. После этого поместите мгновенный клей Loctite в ведерко со льдом.

После этого подготовьте лезвие бритвы и необходимые инструменты для диссекции, такие как пинцет, шпатель и ножницы, протерев их спиртовой салфеткой. Затем проведите эвтаназию мыши путем декапитации и быстро извлеките головной мозг. Поместите мозг в стакан с ледяным раствором сахарозы, A CSF, примерно на 10 минут.

Тем временем подготовьте микротом VIBRAM к срезанию. Поместите дробленый лед в ванночку для образцов. Затем установите камеру с образцом в Vibram и надежно зафиксируйте ее.

Добавьте вокруг камеры для образца больше льда, чтобы заполнить зазоры, следя за тем, чтобы лед не попал внутрь камеры. После этого поместите очищенное лезвие бритвы в держатель для лезвия. Затем заполните камеру для образца ледяным раствором sucrose A CSF.

Затем налейте немного холодного раствора сахарозы А (ЦСЖ) на бумажное полотенце, застелившее перевернутую чашку Петри. С помощью пинцета перенесите свежедиссецированный мозг мыши на полотенце. Затем удалите мозжечок, сделав разрез вдоль медиолатеральной оси лезвием бритвы.

Это создает плоское основание, которое можно закрепить на вибростолике. Затем нанесите каплю клея Loctite на предметный столик. Сразу же закрепите плоский конец подготовленного мозга на столике, стараясь держать его максимально вертикально.

Затем поместите предметный столик в камеру для образца и затяните винт. Убедитесь, что мозг полностью погружен в раствор сахарозы A CSF в камере. После этого с помощью регулятора отрегулируйте положение столика так, чтобы лезвие бритвы совместилось с верхней частью мозга.

Оптимальные параметры вибратома достигаются при установке низкой частоты и скорости. Затем установите толщину среза 400 micrometers. Первые несколько срезов обычно не содержат стриатума.

Повторяйте нарезку до тех пор, пока не будут получены срезы, содержащие стриатум. Как только вы достигнете области stri AAL, с помощью кисти аккуратно поднимите срез и перенесите его в стакан с оксигенированным искусственным спинномозговым жидкостью (CSF) комнатной температуры.

Обычно можно получить от трех до четырех срезов, содержащих таламо-стриатный комплекс, включая хвостатое ядро, скорлупу и прилежащее ядро. Перед началом эксперимента дайте срезам адаптироваться в A CSF, насыщенном смесью 95%O2 5%CO2, при комнатной температуре в течение как минимум одного часа. Для начала данной процедуры подключите трубку к погружной камере регистрации.

Затем подавайте оксигенизированную СМЖ А комнатной температуры со скоростью 1 мл/мин. После того как СМЖ А заполнит специально изготовленный держатель для срезов, установите на контроллере температуры 32 °C. Удалите все пузырьки воздуха под сеткой с помощью иглы шприца.

С помощью шприца создайте отрицательное давление в сливной трубке, чтобы инициировать поток для контроля перелива буфера. Положите салфетку Kim wipe на край держателя среза, чтобы она служила фитилем. Затем перенесите срез в держатель среза в регистрирующей камере, которая непрерывно перфузируется оксигенированным A CSF при комнатной температуре.

Погрузите электрод сравнения «серебро-хлорид серебра» в держатель срезов и подключите его к головному усилителю с помощью зажима-«крокодила». Закрепите углеволоконный микроэлектрод на микроманипуляторе и подключите его к головному усилителю с помощью зажима-«крокодила». Затем опустите вольфрамовый стимулирующий электрод и углеволоконный микроэлектрод до поверхности среза мозга в солевом растворе.

Стимулирующий электрод будет использоваться для подачи одного или нескольких импульсов электрической стимуляции на срез для вызова выброса нейромедиатора с целью измерения электрически индуцированного дофамина с помощью быстросканирующей циклической вольтамперометрии (FSCV) путем подачи на электрод напряжения с треугольной формой сигнала. Поддерживайте потенциал углеволоконного микроэлектрода на уровне -0,4 вольт. Затем увеличьте его до положительного предела 1,2 вольт.

Затем верните потенциал до -0,4 В со скоростью развертки 400 В/с. Стимулируйте срез каждые пять минут и измеряйте объемный поток дофамина (FLX) в течение 15 секунд после получения как минимум трех стабильных записей электрически стимулируемого высвобождения дофамина, под которыми понимаются записи с разницей между высотами пиков менее 10%.

Переключитесь на перфузию среза СМЖ, содержащим интересующим фармакологическим агентом, со скоростью потока 1 мл/мин в течение 30 минут для достижения максимального эффекта, аналогичного базовой записи. Измеряйте электрически стимулируемый выброс дофамина каждые пять минут во время фармакологической перфузии. На рисунке A приведен пример измерения электрически индуцированного выброса дофамина с помощью FSCV после одноимпульсной стимуляции в хвостатом ядре и скорлупе.

На рисунке B представлен трехмерный псевдоцветной график, объединяющий данные зависимостей тока от времени и циклической вольтамперограммы. Аналогично, на рисунках A и C показан выброс дофамина, вызванный одиночным импульсом электрической стимуляции в ядре и оболочке прилежащего ядра соответственно; трехмерные псевдоцветные графики для ядра и оболочки прилежащего ядра представлены на рисунках B и D соответственно. Здесь приведены репрезентативные кривые после обработки среза фармакологическим агентом в течение 30 минут с последующей одноимпульсной стимуляцией для вызывания выброса дофамина в хвостатом puttingумене.

В экспериментах используются следующие агенты: хинол, метамфетамин и нейротрофический фактор мозга. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как подготовить коронарные срезы мозга мыши для регистрации и измерения динамики пресинаптического дофамина с помощью быстрого сканирующего электрохимического метода и телеметрии.