Заливка и запуск Белки гель за счет повторного использования коммерческих Кассеты

Меня зовут Дэвид Оппенгеймер и я работаю на биологическом факультете Университета Флориды. Приобретение предварительно залитых полиакриламидных гелей для рутинного электрофореза белка удобно тем, что вы всегда можете иметь под рукой гели, готовые к использованию. Тем не менее, коммерческие гели могут быть дорогими, если в вашей лаборатории работает много гелей.

Кроме того, коммерческие гели обычно разливаются в пластиковые кассеты, которые предназначены для утилизации после использования, в результате чего образуются пластиковые отходы, которые обычно попадают на свалку. Сегодня мы покажем вам, как повторно использовать эти пластиковые кассеты для заливки ваших собственных полиакриламидных гелей, которые могут храниться неделями, тем самым обеспечивая вашу лабораторию источником недорогих готовых гелей для рутинного электрофореза белка. Итак, приступим.

Подготовьте чистую в Vitrogen новую страницу, мини гелевые кассеты Novak. Удалите примерно одну чайную ложку эпоксидной смолы и полностью перемешайте раствор с помощью наконечника для пипетки. Когда вы закончите смешивать эпоксидную смолу, нанесите эпоксидную смолу на заднюю часть передней кассеты, где передняя и задняя будут соприкасаться.

Когда вы закончите наносить эпоксидную смолу, убедитесь, что в линии нет разрывов. Вставьте лист бумаги примерно толщиной с нижнее отверстие и поместите заднюю часть кассеты сверху. Переместите бумагу, и это предотвратит попадание эпоксидной смолы в скоросшиватель с нижним отверстием.

Обрежьте края для плотного прилегания и оставьте кассету на ночь для полного отверждения. Чтобы приготовить рассасывающий гель, добавьте 2,25 мил растворяющего геля Forex триазы при pH 8,7 в колбу для бокового рукава. Затем добавьте 3,50 мил 30,8% акриламида.

Затем добавьте 3,25 мил двойной дистиллированной воды, чтобы получить общий объем девять мил. Дега раствора в течение 10 минут. Когда раствор будет доведен до состояния газа, удалите девять мил акриламидного раствора в оранжевую пробирку с оранжевым колпачком 50 мил.

Затем добавьте 30 микролитров 10%a PS с шестью микролитрами темида. Чтобы начать процесс полимеризации, обязательно хорошо перемешайте, прежде чем начать заливать разрешающий гель. Убедитесь, что вы закрыли нижнее отверстие изолентой.

Затем налейте раствор внутрь кассеты, позволяя ему стекать по бокам, чтобы предотвратить образование пузырьков. Прекращайте лить, когда вы находитесь примерно в одном сантиметре от вершины. Затем влейте 0,5 мил одного бутанола, пропитанного одним хразрешающим гелевым буфером, чтобы полностью покрыть верх.

Приготовьте укладывающий гель так же, как вы готовите разрешающий гель. В колбу для пистолета добавьте стекляющий гелевый буфер на основе Forex tris с 30,8% акриламида и удвойте количество дистиллированной воды, что в общей сложности составит три мила. Дега на 10 минут и добавить девять микролитров 10%a PS и два микролитра темида.

И обязательно хорошо перемешайте через час. Единственный ал. Дайте разрешительному гелю полимеризоваться по прямой линии.

Тщательно слейте один аль и смойте гель двойной дистиллированной водой. Слейте воду и используйте бумагу, чтобы впитать остатки жидкости. Быстро залейте стекируемый гелевый раствор в кассету и заполните ее как можно полнее.

Затем осторожно вставьте гелевую расческу и с помощью большого зажима для связывания удерживайте расческу на месте. Оставьте гель на срок от одного часа до одного дня Чтобы хранить гель в термосвариваемом пакете. Налейте 20 мил одного стекляющего гелевого буфера с 0,1% азидом натрия Полностью закройте пакет и убедитесь в отсутствии утечек.

Храните гель при температуре четыре градуса Цельсия. Чтобы подготовить образцы белка, добавьте соответствующее количество белка в тонкостенную микропробирку. Здесь мы используем 6,5 микролитров.

Затем добавьте 7,5 микролитров образца буфера без vx trix glycine SCS. Затем добавьте один микролитр 100 миллимолярного DTT и, при необходимости, удвойте количество дистиллированной воды в общем объеме 15 микролитров вашего белка. Инкубируйте образцы при температуре 70 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Настройте гелевый аппарат и налейте во внутреннюю камеру 200 мл одного фильтра для бега трисглицина с 500 микролитрами антиоксиданта NewAge. Затем влейте 300 мил одного дополнительного буфера для работы глицина во внешнюю камеру. Осторожно добавьте образец белка объемом 15 микролитров в лунку с помощью наконечника для пипетки с гелевой загрузкой.

Когда вы закончите загрузку образцов, запустите гель при напряжении 200 вольт в течение 60-90 минут. Когда вы начнете использовать гель, белок начнет мигрировать через полиакриламидный гель в зависимости от размера. Более мелкие белки будут работать быстрее, чем более крупные.

Осторожно извлеките гель из кассеты и трижды промойте гель водой двойной дистилляции в течение пяти минут с легким помешиванием. После третьей стирки испачкайте гель джином in vitro, просто синим безопасным пятном и аккуратно взбалтывайте в течение часа. Слейте стоячий краситель и задержите гель двойной дистиллированной водой.

Если вы хотите более короткие и темные полосы, то вам следует наносить гель в течение более короткого периода времени. Но если вы хотите растянуть дорожки, то запустите его дольше, чтобы удалить эпоксидную смолу, чтобы кассеты можно было использовать повторно. Используйте гелевый нож, чтобы соскоблить другую эпоксидную смолу.

Сегодня мы показали вам, как повторно использовать пластиковые кассеты, которые поставляются с коммерчески доступными полиакриламидными гелями. Важно использовать эпоксидную смолу, предназначенную для пластика, для герметизации гелевых кассет. Также используйте высококачественные реагенты и всегда надевайте перчатки при работе с неполимеризованным акриламидом.

Спасибо и удачи в ваших экспериментах.