Обнаружение микрорегиональном Гипоксия в мышь коры головного мозга на два фотона изображений эндогенной флуоресценции NADH

Общая цель этой процедуры заключается в непосредственной визуализации микрорегионарной гипоксии тканей в коре головного мозга мыши in vivo. Это достигается путем предварительной подготовки открытого черепного окна черепа у мыши, находящейся под наркозом. Затем внутривенно вводится флуоресцентный краситель для маркировки кровеносных сосудов головного мозга.

Наконец, одновременно с фотонной визуализацией проводится собственная флуоресценция NADH и флуоресцентно меченая корковая микроциркуляторная среда. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают функциональную гипоксию в микрообластях паренхимы головного мозга за счет визуализации присутствия восстановленной формы никотинамида, адениндинуклеотида. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как электроды типа Кларка, заключается в том, что она дает высокое специальное разрешение по большому полю зрения, а также является менее инвазивной.

Этот метод может быть проведен на стандартной применяемой двухфотосистеме с двумя флуоресцентными каналами. Здравствуйте, я Стив Херст, профессор и заведующий кафедрой микробиологии и иммунологии в Университете Рочестера, который сегодня будет демонстрировать процедуру сын Аниты из лаборатории Кишка, а также Оксана Полка, научный сотрудник моей лаборатории, доктор Кишка, который первым применил технику визуализации NADH, не может быть здесь сегодня, потому что он недавно переехал в Германию. После подготовки хирургического поля с помощью необходимых инструментов, которые были автоклавы или продезинфицированы 70% этанолом, и мышь была обезболена 5% изофтора, поместите ее на грелку и наложите маску для лица, чтобы доставить от 1,3 до 1,5% изофтора в воздух.

Проверьте уровень анестезии, выполнив защипывание хвостом. Далее введите ректальный зонд и непрерывно измеряйте температуру тела животного на протяжении всей процедуры. Нанесите на глаза мыши искусственный слезный гель, чтобы предотвратить их высыхание.

Затем удалите волосы с головы и оба бедра нанесите средство для удаления волос на бедро на две минуты, чтобы удалить оставшиеся волосы, бедро будет использовано для оксиметрии. Наконец, продезинфицируйте кожу головы с помощью 10% раствора повидон-йода и 70% этанола. Сделать черепное окно начиная с пяти миллиметров прикрепляют к черепу ножницами.

Сделайте надрез на волосистой части головы и продвинуться на один сантиметр. Сдвиньте кожу в стороны, чтобы обнажить череп Чтобы удалить мембраны на верхней части черепа. Нанесите 10% раствор хлорного железа.

Сотрите излишки раствора и соскребите мембраны под углом 45 градусов. Номер пять, пинцет С помощью диссекционного микроскопа определите интересующую область. Нанесите тонким слоем быстрого клея по краям окна головной пластины.

Расположите накладку таким образом, чтобы интересующая область была видна в окне, и слегка надавите на накладку. Нанесите небольшое количество стоматологического цемента для быстрой полимеризации клея. Подержите 10 секунд, пока клей полимеризуется.

Нанесите небольшое количество быстрого клея на края окна, чтобы запечатать головную пластину и череп. Затем прикрутите головную пластину к держателю животного под зоной вскрытия. Использование набора из двух сверл с микрокрутящим моментом при 6 000 об/мин и сверла IRF 0 0 5.

Удалите весь лишний клей с черепа и с головной пластины. Затем установите сверло на тысячу оборотов в минуту и начните сверлить череп, сделав круг внутри окна головной пластины диаметром около пяти миллиметров. Используйте легкие размашистые движения, как будто вы рисуете очень мягким карандашом.

Прекращайте сверление каждые 20-30 секунд и используйте сжатый воздух для удаления костной пыли. По мере бурения вокруг неповрежденного черепа в центре образуется нора. Следите за тем, чтобы не протыкать тонкий череп, но убедитесь, что эта нора имеет одинаковую толщину.

Кроме того, будьте особенно осторожны вокруг крупных кровеносных сосудов. Они не должны быть скомпрометированы, а по возможности даже не должны прикасаться к одному зубцу пинцета, оторвите косточку в центре окна и нанесите на окно каплю искусственной спинномозговой жидкости. Уголком салфетки Kim аккуратно сотрите искусственную спинномозговую жидкость под углом 45 градусов.

Номер пять, пинцет. Найдите область поврежденной твердой мозговой оболочки вдоль края окна и поднимите ее, чтобы удалить. Если кровотечение возникло, нанесите каплю искусственной спинномозговой жидкости и подождите две-три минуты, чтобы незначительное кровотечение остановилось.

Далее приготовьте 10 миллилитров 0,07%низкоплавящейся аэроаэролитра, растворенной в искусственной спинномозговой жидкости. Доведите расплавленный аэрос до температуры тела. Сотрите излишки искусственной спинномозговой жидкости с поверхности головного мозга.

Налейте аэрос в окно и накройте его предметным стеклом. Затем осторожно нажмите на стекло, чтобы обеспечить контакт между стеклом и пластиной головки, и подождите от 10 до 20 секунд, пока аэродинамик не станет твердым. С помощью пинцета и мягкой папиросной бумаги удалите излишки аэро со стеклянной крышки.

Нанесите небольшое количество быстрого клея вокруг стекла, чтобы приклеить его к пластине головки. Затем нанесите небольшое количество стоматологического цемента для затвердевания клея и введите его в бедренную вену. Переверните животное частично, чтобы обнажить внутреннюю сторону левого бедра.

Используйте ленту, чтобы закрепить животное. В таком положении нанесите на кожу антисептический скраб, а затем стопроцентный этанол. Далее сделайте разрез вдоль медиальной поверхности бедра от колена до лобкового синтеза.

При необходимости отделите мягкие ткани с помощью тупой диссекции. Наполните одномиллилитровый шприц 130 микролитрами техасского красного. Прикрепите новую иглу 30 калибра и осторожно согните ее под углом 30 градусов, сохраняя скос вверху.

Заполните иглу раствором Texas Red Solution под микроскопом для вскрытия, введите иглу в бедренную вену и введите сто микролитров Texas red. Извлеките иглу и слегка прижмите вену марлей, чтобы остановить кровотечение. Закройте кожу с помощью четырех швов для непрерывного контроля насыщения крови кислородом.

Поместите зонд оксиметра на правое бедро, с которого ранее были удалены волосы. Чтобы начать визуализацию, перенесите хирургически подготовленную мышь на столик для микроскопа. Сделайте исходный снимок места черепного окна с помощью яркого поля при четырехкратном увеличении, чтобы использовать его в качестве эталонной карты для регистрации с большим увеличением фотонных ани.

Увеличьте интересующую область с помощью 10-кратного увеличения. Выберите область интереса в слоях коры головного мозга. Один или два начинают записывать временные ряды.

Мы рекомендуем использовать в среднем от трех до пяти кадров для повышения качества изображения. Затем вызовите гипоксемию, добавив 50% азота в воздух, которым дышит животное. Это позволит довести уровень кислорода до 10%Проверьте гипоксемию, контролируя данные оксиметра.

Продолжайте записывать временной ряд через гипоксемию в течение примерно 30 секунд и после того, как нормальный уровень кислорода восстановится. Собирайте данные для расчета распределения кислорода путем обнаружения, измерения и количественной оценки площади гипоксии и кислородных тканевых цилиндров вокруг кровеносных сосудов. Чтобы определить радиус цилиндра кваксивой ткани R, измерьте расстояние между центром кровеносного сосуда и границей, на которой обнаруживается высокая флуоресценция НАДН.

Обратитесь к письменному протоколу для получения информации о методах обработки данных. На этом рисунке показаны одновременные изображения NADH и географические изображения из видео, записанных во время транзиторной гипоксемии, концентрация кислорода во вдыхаемом воздухе была снижена с 21% до 10% в течение трех минут. Этот уровень экспериментально индуцированной гипоксемии достаточен для того, чтобы вызвать тяжелую гипоксию в коре головного мозга.

Гипоксия приводила к увеличению флуоресценции НАДН, первоначально показанной зеленым цветом в областях, наиболее удаленных от артериального кровоснабжения. Обратите внимание, что резкие границы тканей НАДН, которые представляют собой наблюдаемые тканевые границы диффузии кислорода из корковой микроциркуляции, показаны красным цветом. Вот параллельное изображение флуоресцентно меченых микрососудов коры красным цветом и внутренней флуоресценцией NADH от серого вещества коры зеленым цветом, распределение интенсивности флуоресценции NADH является бинарным.

Существуют области с равномерно низкой флуоресценцией NADH и области с равномерно высокой флуоресценцией NADH. Желтыми линиями обозначены границы тканей между участками с низкой и высокой флуоресценцией НАДН. Эти границы тканей демонстрируют пространственное отношение к близлежащим микрососудам.

Эта взаимосвязь определяется диффузией кислорода из микрососудов в ткани. В некоторых случаях цилиндрическая природа или тканевый цилиндр CRO этих границ тканей могут быть непосредственно распознаны, как указано синими линиями. Здесь тканевая граница имеет круглую форму с концентрическим центральным кровеносным сосудом после освоения.

Эту методику можно сделать за 1,5 часа, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать приклеивать защитное стекло к металлической пластине, чтобы предотвратить вертикальное движение поверхности коры головного мозга из-за отека. После этой процедуры могут быть проведены дополнительные анализы, такие как измерение функциональной гиперемии, с целью решения дополнительных вопросов, таких как взаимосвязь между тканевой гипоксией и цереброваскулярным взаимодействием.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как визуализировать микрорегионарную гипоксию тканей в коре головного мозга мыши.