Обнаружение белковых взаимодействий в завод использованием шлюза Совместимость комплементации флуоресценции Бимолекулярные (BiFC) Системные

Чтобы проверить взаимодействие между двумя белками, два интересующих их гена должны быть клонированы в наш БФ и векторы с использованием техники шлюзового желания. Эти конструкции преобразуются в аэрий GV 3 1 0 1. Бактериальные культуры GV 3 1 0 1, содержащие конструирование, будут смешиваться и проникать в листья.

Если два белка-кандидата взаимодействуют друг с другом, сигнал YFP можно наблюдать с помощью фокуса результата в Мексике. Основной целью метода BFC является проверка взаимодействия между двумя белками. В vavo мы создали серию шлюзосовместимых BFC и IS двух гибридных векторов, которые предоставляют исследователям простые в использовании инструменты для выполнения двух гибридных анализов BFC и ISTO.

В этом видео мы продемонстрируем простоту использования нашей системы BFC. Чтобы проверить белок, белковые взаимодействия не должны выходить за пределы системы экспрессии. Для начала нужно подготовить GV 3 1 0 1 бактериальную культуру.

Вам нужно выбрать одну колонию из вашей тарелки и привить пяти самцам среды YEB соответствующие антибиотики. Затем нужно встряхнуть эту культуру на ночь при температуре 28 градусов. Скорость составляет 200 пробежек в минуту.

Бактериальные культуры должны быть готовы на следующее утро. Убедитесь, что бактерии D переросли. Выньте культуры из инкубатора и перенесите по одному самцу каждой культуры в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 самца.

Поместите пробирки центрифуги в настольную центрифугу. Уменьшите количество бактерий при 1000 г в течение 10 минут при комнатной температуре, выбросьте снет. Затем наблюдайте за пенатом, добавляя один прием инфильтрационной среды, и повторите оценку по петтингу несколько раз.

Повторите шаг стирки еще два раза. Это важно, потому что это помогает удалить следы антибиотиков в бактериальной среде, которые вызывают у вас уплотнения растений после инфильтрации. После окончательной промывки операционную суспензию поддона в 0,5 единицы инфильтрационной среды от 600 единиц этой бактериальной суспензии используют спектрофотометр с использованием инфильтрационной среды в качестве контроля банка.

После измерения наружного диаметра необходимо отрегулировать внешний диаметр с помощью инфильтрационной среды. Итоговый OD должен быть в диапазоне от одного до 1,2. Вы должны подготовить все бактериальные суспензии, прежде чем переходить к следующему этапу.

Перенесите равное количество бактериальных суспензий, соответствующих двум белкам-кандидатам, и смешайте их в новой 1,5-дюймовой мужской трубке Отрицательная смесь бактерий теперь относится к инфильтрату. Подготовьте все комбинации и не забудьте включить негативный контроль. Вы должны использовать пять-шесть недельных кодов и наилучшим образом использовать растения для проникновения.

Вы можете удалить растения из комнаты для выращивания и поместить их на ночь за час до проникновения, чтобы открыть штормовую атаку. Это поможет в процессе проникновения. Наберите около 100 микролитров Резуса взвешенных бактерий.

Смешайте возле одного самца соскочивший наконечник шприца без иглы. Приложите кончик шприца к нижней стороне листа ly. Поддержите пальцем верхнюю сторону колена.

В общем, надавите на поршень. Вы должны быть в состоянии видеть, как жидкость диффундирует через лист, но чувствует, что мезоболее тонкие воздушные пространства после инфильтрации позволяют проникнуть в воздух с помощью маркерного пера. В противном случае, через два дня, вы не сможете идентифицировать инфильтрированный А. Если вам необходимо инфильтровать С другой смесью бактерий, обязательно распылите на перчатку 50% этанол или смените перчатки G между инфильтрациями.

Старайтесь оставлять расстояние в один метр между просадками, чтобы предотвратить перекрестное заражение. Сигналы PFA следует контролировать каждые 24 часа с момента инфильтрации до пяти дней. Для хранения образца можно использовать два чехла разных размеров.

Сначала нанесите одну каплю мини-воды на рукав с надрезной крышкой. Затем отрежьте небольшой кусочек ткани ножа в пределах инфильтрированной зоны. Старайтесь избегать тошноты вены в пробе.

Положите отрезанную ткань ножа в воду на горку, под нее опуститесь, накройте ее с помощью рукава меньшего размера и слегка прижмите. Теперь образец можно наблюдать под мексикой. Здесь мы используем этот NACA T CSS P два конфокальных Мексики для визуализации сигнала BIFC.

Можно использовать даже обычный аромат Мексика. Конфокальный обеспечивает более качественное изображение и обнаруживает слабые сигналы. Параметр YFP можно использовать для обнаружения сигналов VFC в данной системе NCA P two.

Вы можете просто дважды щелкнуть по этой предустановке YFP здесь, которая автоматически включит возбуждение и установит дальность обнаружения излучения. Если вы используете другую систему, обратитесь к руководству, чтобы правильно настроить параметры. Мы надеемся, что после просмотра этого видео вы сможете провести BFCE для тестирования белковых взаимодействий с использованием системы экспрессии unbe MI Transcend.

Также можно применять эту процедуру к табаку и растениям AY. Наши векторы BFC также содержат HA и флаг соответственно, поэтому вы также можете выполнить co IP для проверки взаимодействий, если это необходимо.