Аннотация завод функции генов с помощью комбинированного Genomics, метаболомики и информатики

Общая цель данного эксперимента заключается в выявлении и характеристике новых функций генов с помощью аннотации генов путем комбинированного анализа метаболомного профилирования и коэкспрессионного анализа. Это достигается за счет разработки экспериментального дизайна с упором на конкретные метаболические пути и виды растений. На втором этапе используются аналитические подходы для построения полной схемы метаболического пути на основе химических структур обнаруженных соединений.

Далее структура предсказанного пути интегрируется с анализом коэкспрессии для сужения круга генов-кандидатов, которые, предположительно, указывают на ключевые гены метаболизма. В конечном итоге результаты получаются путем проведения минимального набора экспериментов с эффективным использованием нескольких биоресурсов для функциональной идентификации генов. Впервые идея этого метода возникла у нас, когда мы обнаружили очень высокую корреляцию биоцистических генов Abosi OID в базе данных коэкспрессии под названием ate.

Мы полагаем, что данная стратегия является одним из наиболее быстрых способов поиска функций новых генов с использованием общедоступных баз данных и эффективным применением биоресурсов. Для начала экстракции соберите растительный материал и немедленно заморозьте его в жидком азоте. После заморозки измельчите растительный материал в порошок с помощью шаровой мельницы, перенесите аликвоты замороженного материала в пробирки EOR объемом 2 мл и добавьте в каждую пробирку металлический шарик.

Добавьте 250 µL экстракционного буфера на каждые 50 mg образца. Экстракционный буфер содержит внутренний стандарт для нормализации. После этого гомогенизируйте замороженный порошок в шаровой мельнице в течение двух минут.

При частоте 25 центрифугируйте образец при 12 000 об/мин в течение 10 минут. Затем перенесите супернатант в центрифужный фильтр. После проведения второго раунда центрифугирования перенесите супернатант в новую пробирку Эппендорф.

Затем подготовьте систему ВЭЖХ, предварительно убедившись, что температура в термостате колонки составляет 35 °C, а температура в лотке для образцов — 10 °C. Настройте параметры масс-спектрометрии и проверьте состояние вакуума и нагревательного капилляра. Выполните калибровку масс-заряда детектора МС путем инфузионного введения смеси калибровочных растворов.

Используйте приложение для автоматической калибровки в программном обеспечении. Затем перенесите 50 µL экстрактов в стеклянный флакон. Для ВЭЖХ перед анализом первого образца выполните не менее пяти инъекций экстракционного буфера, как описано в письменной процедуре.

После настройки инструмента анализа методом масс-спектрометрии выберите данные для обработки. Подготовьте таблицу обнаруженных интересующих пиков в соответствии с классом соединений, указанным в письменном протоколе. На данном этапе идентифицируйте пики по совместной эволюции со стандартными соединениями, аннотируйте обнаруженные пики с помощью MS/MS-анализа, литературных данных, общего анализа и поиска по базам данных метаболитов.

Предсказание метаболического пути должно основываться на химических структурах путем установления связи с ферментативной функцией в метаболическом пути. Таким образом, эти этапы должны выполняться на основе точной идентификации обнаруженных соединений. Базы данных общих метаболических путей, такие как база данных KEGG и Plant Pathway, весьма эффективны для предсказания интересующего метаболического пути.

Для подготовки списка генов с ортологами Arabidopsis и их ID сначала загрузите список ID генов из геномной базы данных. Если целевое растение не является Arabidopsis, добавьте ID соответствующих генов-ортологов Arabidopsis. Затем подготовьте список генов, участвующих в интересующем вас метаболическом пути.

Аннотации данных о путях Arabidopsis и данных о семействах генов доступны на веб-сайте TAAR. Затем можно объединить списки генов-ортологов Arabidopsis. Выполните анализ сети коэкспрессии, используя подготовленный список ID генов для поиска в наиболее подходящей базе данных для прогнозируемого пути.

Проверка корреляции известных пар генов в исследуемом пути. Если база данных коэкспрессии или база данных экспрессии генов недоступны, для интересующего плана следует использовать базу данных коэкспрессии Arabidopsis со списком аутологичных генов Arabidopsis.

Затем постройте структуру целевой сети коэкспрессии. На основании связей известных генов в интересующем пути добавьте коррелирующие гены-кандидаты и проверьте их аннотацию в предсказанных семействах в рамках связей этой сети для поиска наиболее подходящего кандидата.

Пороговое значение коэффициента для генов должно быть скорректировано в соответствии со структурой сети и плотностью коррелирующих генов. Теперь составьте список генов, которые можно определить как специализированные для целевого сигнального пути. Используя этот список, проверьте экспрессию генов-кандидатов в зависимости от специфики органов и стрессовых ответов.

Начните интеграцию информации, добавив в предсказанный метаболический путь хорошо изученные гены, которые использовались для анализа коэкспрессии. Проведите поиск по литературе, чтобы определить, являются ли неизученные части этого пути новыми, включая нехарактеризованные ферментативные стадии, транспортные белки и транскрипционные факторы. На данном этапе предложите наиболее подходящую аннотацию генов для этих отсутствующих неизученных стадий.

Объедините результаты профилирования метаболитов и гены-кандидаты, выявленные в ходе анализа экспрессии генов in silico на основе предсказанного метаболического пути. Затем распределите гены-кандидаты по предсказанному пути в соответствии с функцией генов. Например, ацетилтрансферазы для ацетилированных метаболитов, гликозилтрансферазы для гликозидов и P450 для окисленных соединений.

Проверьте согласованность тканеспецифичности или стрессовых ответов между накоплением метаболитов и уровнем экспрессии генов-кандидатов. Также изучите связи с другими путями метаболизма для обеспечения субстратами и экспрессии стресс-индуцируемых генов. В качестве заключительного этапа проведите эксперимент по определению функции гена, используя такие биоресурсы, как библиотека нокаутных мутантов и библиотека полноразмерных кДНК.

Ниже представлен пример анализа сети корегуляции пути биосинтеза антоцианов. Анализ коэкспрессии проводился с использованием индекса коэкспрессии PRAM на основе набора данных версии 3; программа PX отображает красными узлами 12 ферментативных генов антоцианов и два транскрипционных фактора, отвечающих за синтез антоцианов, которые были использованы для поиска генов-кандидатов. Сеть коэкспрессии, включающая 68 коррелирующих генов-кандидатов и 14 искомых генов, была реконструирована путем перекрестного поиска в базе данных Prime, в результате чего были получены выходные файлы T-net, визуализированные с помощью программного обеспечения PX.

Синие узлы обозначают гены-кандидаты, которые коррелировали с генами антоцианов после их развития. Эта стратегия даст нам ценную подсказку для прогнозирования функций новых генов в метаболизме растений.