Изоляция и биофизических исследований фруктов кутикул

В данном эксперименте используются биофизические методы для оценки способности к сшиванию полимера кожицы томата, который обладает защитными свойствами, а также для мониторинга селективного удаления эпикутикулярных и внутрикутикулярных восков из кутикулы плодов. Выделение кутикулы из целого плода осуществляется путем ферментативной обработки кожицы томата и прилегающих клеточных стенок. На втором этапе используется экстракция для полного удаления воска из кутикулы плода с целью получения молекулярных характеристик выделенного кутина.

Анализ биополиэстера проводится методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в твердом теле. Спектральный анализ ЯМР в твердом теле показывает, что в кутине кутикул плодов томатов дикого типа и генно-модифицированных линий существуют различия в относительных пропорциях оксигенированных аллифатических фрагментов, способных к образованию поперечных связей. В качестве альтернативы, всю поверхность плода покрывают гуммиарабиком и снимают кожуру для удаления эпикутикулярного воска, после чего плод погружают в хлороформ для удаления интракутикулярного воска из кутикулы.

Затем кутикулы, частично очищенные от воска с помощью той же ферментативной обработки, что и кожица томатов, исследуют с помощью ЯМР в твердом теле и атомно-силовой микроскопии. В конечном итоге последовательное удаление эпикутикулярных и интракутикулярных восков становится очевидным при наблюдении за прогрессирующим уменьшением пика воска в спектрах ЯМР и изменениями профиля поверхности кутикулы плода, регистрируемыми с помощью параллельной АСМ-визуализации. Надземные органы растений защищены биополиэстерным восковым комплексом, называемым кутикулой. Мы представим протоколы для оценки селективного удаления внутренних и внешних восков из кутикул плодов томата с использованием ядерного магнитного резонанса в твердом теле и атомно-силовой микроскопии.

Эти методы также могут быть использованы для оценки способности к сшиванию модифицированных кутикулярных материалов. Процедуры продемонстрируют трое участников группы: др. Ишиш Чаттерджи, аспирантка Шантани Саркар и бывшая ученица старшей школы Юлия Тик. Дополнительным демонстратором выступит др. Оливия Нисау, постдокторант в лаборатории нашего коллеги по химическому инжинирингу, др. Александра С. Чтобы начать ферментативную изоляцию кожицы томата, поместите три коммерческих или выращенных плода в чашу, снимите кожицу крупными фрагментами и удалите внутреннюю ткань перикарпия.

Затем промойте кожицу томатов деионизированной водой и поместите ее в стакан с жидкостью, полностью погрузив очищенную кожицу томатов в ферментный коктейль, приготовленный согласно описанному в письменном протоколе методу. Инкубируйте при 31 °C в течение 24 часов при непрерывном перемешивании. Соберите кожицу томатов с помощью воронки Бюхнера или кухонного сита и промойте ее деионизированной водой.

После выдерживания кожуры в вакуумном oven при комнатной температуре в течение одного часа высушенную кожуру можно хранить в промаркированном флаконе с крышкой. Для последующих процедур по удалению воска заполните центрируемую стеклянную или одноразовую пробирку-насадку примерно наполовину образцом кутикулы томата; с помощью пинцета осторожно поместите её в основание экстракционной колонки, которая будет использоваться для твердофазной экстракции. Продолжите сборку установки для твердофазной экстракции, используя метанол в качестве растворителя, как описано в письменном протоколе.

Следите за процессом в течение часа, регулируя напряжение на вариаке так, чтобы в приемнике скапливалось примерно по одной капле в секунду и происходил сифонный перенос внутри устройства. Когда насадка заполнится после 12-часовой экстракции, дайте аппарату остыть, затем опустите нагревательный кожух и снимите экстрактор вместе с приемником единым блоком, чтобы утилизировать растворитель после завершения экстракции. Наклоните колонку, чтобы обеспечить слив содержимого в колбу под ней.

С помощью пинцета поднимите тигель до уровня чуть ниже шейки экстракционной колонки. Слейте из него излишки растворителя и поместите тигель на чистую поверхность. Отсоедините колбу и слейте отходы в соответствующий промаркированный контейнер для растворителей.

Повторите процедуру экстракции с использованием последовательности растворителей с постепенно снижающейся полярностью, например, хлороформа и гексана, по 12 часов для каждого. После высушивания образца кутикулы томата измерьте его массу и храните при комнатной температуре в стеклянной банке с завинчивающейся крышкой, герметизированной парафильмом. Для подготовки образца к ЯМР поместите от четырех до шести миллиграммов полностью очищенной от воска кутикулы томата (кутина) в циркониевый ротор для быстрого MAS размером 1,6 мм, используя инструмент для заполнения, поставляемый производителем.

После установки верхней крышки закрасьте половину крышки черным перманентным маркером, чтобы обеспечить возможность измерения скорости вращения. Первоначальная настройка эксперимента по твердофазному ЯМР представляет собой технически сложный процесс и выполняется под руководством опытного персонала. Начните с регулировки однородности магнитного поля и оптимизации параметров эксперимента, используя модельное соединение, как описано в письменном протоколе. Вставьте подготовленный и заполненный ротор в зонд, а затем поместите зонд в магнит.

Постепенно увеличивайте скорость вращения до 10 килогерц, чтобы убедиться в плотной упаковке образца и способности ротора вращаться стабильно с отклонением менее 20 герц. Итеративно настраивайте конденсаторы настройки и согласования зонда для достижения минимального отражения мощности на частотах ЯМР протонов и углерода 13. Установите температуру эксперимента на 25 °C.

Запустите предварительно оптимизированный эксперимент CPMA, соответствующий условию согласования протонов и углерода по Хартману-Хану, определенному при частоте вращения 10 kHz. После регистрации 4 096 транзиентов обработайте спектр с помощью экспоненциального уширения линии от 50 до 100 Hz и выполните преобразование Фурье для получения ЯМР-спектра зависимости интенсивности сигнала от химического сдвига в ppm. Приведите химические сдвиги углерода 13 в соответствие с данными, описанными в тексте.

Увеличьте частоту вращения ротора до 15 килогерц и повторите измерение C-P-M-A-S, соответствующее условию согласования Хартмана-Хана, определенному при анализе химического сдвига C-P-M-A-S углерода при частоте вращения лестницы. Спектры 13 NMR выявили основные функциональные группы, присутствующие в полностью удаленном воском кутикуле томата: длинноцепочечные PHA, оксигенированные PHA, многосвязные и ароматические соединения, а также выходы углерода. Оксигенированные PHA играют решающую роль в установлении ковалентных связей между мономерными единицами биополимера кутина, формируя таким образом молекулярную архитектуру матрицы кутина.

Различия в относительных площадях пиков, наблюдаемые в спектральной области от 45 до 100 parts per million, позволяют предположить, что в мутантном кутине содержится относительно большая доля CHO-структурных фрагментов, образующих поперечные связи, по сравнению с кутином дикого типа. Для начала селективного выделения эпикутикулярных и внутрикутикулярных восков.

Промойте вторую партию целых томатов дистиллированной водой. Обсушите их бумажными полотенцами и салфетками Kim wipes, затем выложите их плодоножкой вниз на лист алюминиевой фольги. Покройте целые томаты 120% водным раствором гуммиарабика, нанося его сверху вниз.

Дайте гуммиарабику высохнуть на кожице плода в течение одного часа до образования тонкой пленки. Удалите эту пленку с помощью пинцета, стараясь не проколоть кожицу томата. Дальнейшая обработка пленки, описанная в тексте, позволяет выделить эпикутикулярный воск.

Томаты останутся физически целыми. Погрузите их в хлороформ на две минуты. При комнатной температуре внутрикутикулярный воск можно собрать после испарения растворителя; затем очистите томаты от кожуры и подвергните их ферментативной обработке целлюлазой и пектиназой в натриум-ацетатном буфере для удаления целлюлозы и пектина соответственно.

Затем можно провести экстракцию с использованием sali, как было описано ранее, для полного удаления воска из томатов. Эксперименты C-P-M-A-S можно повторить с образцами естественной и частично очищенной от воска кутикулы плодов, как описано в тексте. Настройка атомно-силового микроскопа — это сложный процесс, который лучше всего проводить под первоначальным руководством опытного технического персонала. Работа с FM начинается с включения сканирующего зондового микроскопа (сокращенно SPM) и проверки того, что переключатель режимов микроскопа установлен в режим контактной атомно-силовой микроскопии.

Затем вручную поднимите головку SPM, поворачивая две регулируемые передние ручки. Отсоедините держатель кантилевера AFM от головки SPM, повернув зажимной винт на задней стороне головки. С помощью пинцета извлеките установленный кантилевер AFM из держателя.

Затем осторожно извлеките из упаковки новый кантилевер с нитрид-кремнеземным наконечником и установите его вместо старого. С помощью светового микроскопа убедитесь, что вновь установленный FM-кантилевер не поврежден. Закрепите образец кутикулы томата на предметном стекле с помощью двусторонней клейкой ленты.

Используйте световой микроскоп, чтобы убедиться, что образец кутикулы остается плоским и гладким. После размещения образца на диске установите образец кутикулы томата, закрепленный на диске, на магнитную область в верхней части сканера SPM. Поворачивая ручки, установите два передних ручных винта сканера достаточно высоко, чтобы избежать поломки зонда A FM.

При установке держателя зонда в головку SPM установите моторизованный задний винт примерно на тот же уровень, что и два передних винта. Снова вставьте держатель зонда в головку SPM и зафиксируйте его, затянув задний зажимной винт головки. После включения лазера совместите лазерное пятно с FM-кантилевером с помощью центрального и правого регуляторов юстировки лазера, расположенных на верхней части головки.

Контролируйте отраженный лазерный луч на листе бумаги, чтобы точно расположить лазерное пятно на конце FM-кантилевера. Отрегулируйте положение лазерного пятна для достижения максимального суммарного сигнала. Отрегулируйте положение отраженного лазерного пятна на фотодетекторе, перемещая подвижное зеркало по горизонтали и вертикали, чтобы падающий свет равномерно распределялся по четырем квадрантам.

Детектор опускает зонд FM, разжимая регулируемые пользователем передние винты и моторизированный задний винт сканера SPM. Визуально контролируйте приближение зонда FM к поверхности образца с помощью инвертированного микроскопа. Убедитесь, что все три винта находятся на одном уровне.

Чтобы избежать артефактов при сканировании наклоненного образца, подведите зонд к образцу, но не слишком близко, чтобы он не коснулся и не пробил поверхность образца. Лазерный луч, отраженный от кантилевера A FM, будет отражаться от подвижного зеркала на фоточувствительный детектор для работы в контактном режиме A FM с использованием нитрид-кремниевого зонда A FM. Установите напряжение выходного сигнала на -2 В для нулевой уставки напряжения и дифференциальный сигнал на 0 В, отрегулировав положение зеркала.

Используя программное обеспечение nano scope, нажмите на значок микроскопа и выберите соответствующий профиль. С помощью панели настроек управления сканированием установите скорость и размер сканирования.

Позвольте зонду АСМ коснуться поверхности образца, нажав на значок «engage tip» (привести зонд в контакт). С помощью управления моторизированным задним винтом основания СМЖ программа опустит зонд до момента его соприкосновения с поверхностью образца. После успешного контакта зонда процесс сканирования начнется автоматически.

Контролируйте процесс сканирования, используя режимы изображения и осциллограммы программного обеспечения, и итеративно настраивайте параметры для получения изображений с наивысшим разрешением, как описано в письменном протоколе. Например, начните сканирование со значения масштаба данных по оси Z большого размера. Затем осторожно уменьшайте значение масштаба данных по Z для достижения наилучшего контраста особенностей поверхности на изображении.

Снимите изображение, чтобы сохранить файл данных. Обработайте данные с помощью функций выравнивания для устранения артефактов изображения, вызванных вертикальным дрейфом сканера, изгибом изображения и вертикальным смещением между линиями сканирования. В завершение рассчитайте среднюю шероховатость углерода.

Спектры 13 C-P-M-A-S-N-M-R показали постепенное уменьшение пика воска при 31 parts per million, что указывает на последовательное удаление эпикутикулярных и интракутикулярных восков из композита кутикулы и воска при сохранении основной химической архитектуры биополимера кутина. Анализ FM-изображений выявил неровности поверхности, вызванные ступенчатой экстракцией эпикутикулярного и интракутикулярного восков из кутикулы плода, что свидетельствует об изменениях в организации кутикулярного комплекса. После освоения данной методики последовательное удаление эпи- и интракутикулярных восков из кутикул плодов томата может быть выполнено за два часа.

При проведении твердофазной экстракции для исчерпывающего анализа кутикул плодов после использования контактного узла важно использовать набор растворителей различной полярности. Здесь представлен протокол FM. Дополнительные эксперименты FM могут быть использованы для измерения эластичности поверхности кутикулы.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как систематически выделять компоненты из композита кутин-воск, а также проводить молекулярную характеризацию и экспресс-анализ поверхности материалов кутикулы с помощью твердотельного ЯМР и АСМ соответственно. Методы, продемонстрированные в этом видео, позволяют исследователям в области биологии растений определять молекулярный состав и надмолекулярную архитектуру природных и модифицированных растительных тканей.