Экспериментальная система по изучению механотрансдукции в эмбриональные клетки легких

Механические силы играют ключевую роль в развитии легких и повреждения легких. Здесь мы опишем метод, чтобы изолировать грызунов плода легкого типа II эпителиальных клеток и фибробластов и подвергать их механическим раздражением использования

Целью данной процедуры является описание экспериментальной системы для изучения механической трансдукции в клетках легких плода. Это достигается путем кодирования культуральных планшетов белками внеклеточного матрикса. Затем выделяют эпителиальные клетки легкого плода мыши второго типа, после чего выделяют фибробласты эмбриональной мыши.

Последний этап описывает систему in vitro для обеспечения механической стимуляции клеток легких. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают увеличение дифференцировки клеток второго типа с помощью ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга и флуоресцентной иммунохимии. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области механической трансдукции, такие как развитие легких плода и повреждение легких.

Демонстрировать процедуру будет Джулиан Гу, техник из моей лаборатории, пока мы работаем в ламинарном проточном шкафу в стерильных условиях, производит 120 микрограммов ламинина с 12 миллилитрами холодного стерильного одного XPBS на пластину. Для покрытия могут быть использованы другие белки внеклеточного матрикса. Обратитесь к письменному протоколу для получения подробной информации, затем возьмите необработанную пластину BioFlex и добавьте два миллилитра раствора ламината в каждую лунку до конечной концентрации два микрограмма на квадратный сантиметр.

Убедитесь, что лунки полностью покрыты раствором. Полностью накройте пластину полиэтиленовой пленкой и положите на ровную поверхность в среду с температурой четыре градуса Цельсия на ночь, чтобы ламинат впитался на дно лунок. Пластины с покрытием могут храниться в этих условиях не менее недели, сохраняя при этом хорошую функцию ECM на следующий день.

В стерильных условиях промыть лунки трижды одним XPBS. Затем добавьте по одному миллилитру 1% БСА в одном XPBS в каждую. Хорошо инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение одного часа, чтобы блокировать неспецифические участки связывания на мембранах.

Затем снова промойте лунки три раза одним XPBS. Чтобы удалить неабсорбированные белки, добавьте по одному миллилитру DMEM в каждую лунку тарелки. Затем храните пластину при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока эпителиальные клетки легкого второго типа плода грызуна не будут выделены и готовы к нанесению покрытия.

За день до начала процедуры изоляции клеток соберите чашки экрана с нейлоновыми сетками 130 и 15 микрон и простерилизуйте их методом автоклавирования. Также автоклавное такое же количество 150 миллилитрового стекла пикирует в день культуры. Получить легкие плода от беременной мыши на период с 17 по 19 срока беременности.

Перенесите ткань в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую среду ДМЭА, и положите ее на лед. Приготовьте буфер для свежего сбраживания в центрифужной пробирке объемом 50 миллилитров в соответствии с рецептурой в письменном протоколе. А во время работы в вытяжном фильтре с ламинарным потоком стерилизовать через шприцевой фильтр 0,2 мкм.

10 миллилитров этого буфера достаточно для легочной ткани, полученной примерно от 20 плодов мышей. Поместите коническую трубку, содержащую буфер для пищеварения, на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия. Извлеките дий из конической трубки, содержащей легочную ткань плода, и перенесите ткань в стерильную чашку Петри с помощью стерильных ножниц или бритвенного лезвия, измельчите ткань на кусочки размером менее одного миллиметра.

Затем перенесите ткань в коническую трубку, содержащую буфер для предварительного размножения. Затем механически помогите перевариванию ткани, пипетируя суспензию клеток легких плода вверх и вниз по сто раз с помощью пипеток с уменьшающимся размером апертуры. После завершения процесса разложения центрифугируйте гомогенат при 1300 об/мин в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем осторожно удалите лежачий на спине путем аспирации и ресуспендируйте гранулу, содержащую клетки в 15 миллилитрах DMEM плюс 20% FBS. Затем извлеките чашки сита с нейлоновыми ячейками 130 и 15 микрон и поместите их поверх стерильных стаканов объемом 150 миллилитров. Пипеткой пейте гомогенат клеток на ячейки размером 100 микрон.

Соберите фильтрат и нанесите его пипеткой на ячейку размером 30 микрон. Промойте сетку 30 микрон несколько раз свежим DMEM плюс 10% FBS. Большая часть ячеек второго типа слипается и не проходит через сетку.

Эти промывки удаляют неэпителиальные клетки, которые могут прикрепляться к скоплениям. Нанесите фильтрат из ячейки 30 микрон на чашу сетки 15 микрон. Снова постирайте несколько раз, как и раньше.

На этом этапе рекрутируются клетки второго типа, которые могли пройти через сетку размером 30 микрон. Соберите слипшиеся нефильтрованные клетки из ячеек 30 и 15 микрон для дальнейшего обогащения клеток второго типа. Удерживайте фильтрат из сетки 15 микрон, если необходимо культивировать фибробласты легких плода грызунов.

В противном случае выбросьте этот фильтрат. Дальнейший. Очистите популяцию эпителиальных клеток второго типа путем добавления среды и инкубируйте неотфильтрованные клетки из чашек с ячейками 30 и 15 микрон в колбе для культуры тканей площадью 75 квадратных сантиметров в течение 30 минут после этой инкубации центрифугируйте суперназвание, как и раньше, дегранулируйте клетки, а затем повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах сыворотки свободной сыворотки DMEM pro fetus пипетке по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую лунку с покрытием из ламината BioFlex с шестью лунками планшетов на этом этапе клетки появляются в комки, при наблюдении под микроскопом инкубируют планшет в инкубаторе для тканевых культур, установленном при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Оптимальной является 24-часовая инкубация, и требуется минимум шестичасовая инкубация.

Прежде чем начать эксперименты с механическим напряжением, возьмите фильтрат из сетки 15 микрон и переложите в колбу для культуры тканей площадью 75 квадратных сантиметров при температуре 37 градусов Цельсия на 30–60 минут, чтобы фибробласты могли прилипнуть, аспирировать и отбросить насыщение. Затем замените объем в колбе на DMEM без сыворотки и инкубируйте в течение ночи. На следующий день соберите клетки с 0,25% трипсина в 0,4 миллимоляра ЭДТА и поместите их на пластины BioFlex, покрытые фибронектином, инкубируйте в инкубаторе для тканевых культур, установленном при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, в идеале в течение 24 часов до начала экспериментов с механическим напряжением.

Если для проведения экспериментов требуется не менее шести часов, то требуется минимум шестичасовая инкубация. Клетки второго типа поддерживаются в бессывороточных колбах DMEM 75 квадратного сантиметра после выделения, а на следующий день клетки трипс инизируются подсчетом, а затем сидящий монослой должен быть не более чем на 80% слитым до начала экспериментов. В день эксперимента по механической стимуляции среду для культивирования клеток заменяют двумя миллилитрами свежего DMEM без сыворотки крови на лунку, а затем планшет устанавливают в штаммовую установку FX 5000 flex cell FX 5,000.

Далее приложите к мембранам двухосную деформацию EQU. Режим деформации изменяется в зависимости от моделирования механических сил in vivo. Как обсуждается в письменном протоколе, клетки, выращенные на не-ST растянутых мембранах.

Параллельно культивируемые используются в качестве контроля для эксперимента. В конце эксперимента монослои могут быть обработаны для анализа изменений экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени или изменений в обилии белка с помощью вестерн-блоттинга. Кроме того, монослои могут быть закреплены для иммунохимических экспериментов по этой методике.

После фиксации астиковые мембраны вырезаются из пластин и устанавливаются на стеклянные предметные стекла с использованием от 10 до 20 микролитров воды в качестве монтажного агента перед проникновением и инкубацией с антителами. Супердатин из эксперимента также может быть использован для исследования наличия высвобождаемых веществ, таких как факторы роста или цитокины. На этом изображении показаны пармальные фиксированные эпителиальные клетки E 18 плода второго типа, которые были выделены, как в этом протоколе, и нанесены на планшеты BioFlex, закодированные ламинином.

Камеры были закреплены и сделан снимок. На следующий день после не-ST стрейч-клетки были пломбированы. Чистота клеток была определена как 90 плюс-минус 5% с помощью микроскопического анализа морфологии эпителиальных клеток и иммуноокрашивания на сурфактант белок С. На следующих рисунках представлены данные об эпителиальных клетках плода второго типа, которые подвергались воздействию 5% циклического штамма со скоростью 40 циклов в минуту в течение 16 часов.

Этот северный блоттинг экспрессии мРНК поверхностно-активного белка C иллюстрирует, что штамм индуцирует дифференцировку клеток второго типа с использованием различных субстратов ECM. Знаки плюс минус представляют подверженность деформации или ее отсутствие, соответственно. Данные экспрессии представлены на гистограмме в виде среднего значения плюс или минус SEM, где N равно трем, а звездочка указывает на значение P меньше 0,05.

Эти флуоресцентные иммунохимические изображения показывают уровни белка С поверхностно-активного вещества в зеленом цвете. При типе плода две клетки, не подверженные механической нагрузке слева и не подверженные механической нагрузке на правые ядра, были окрашены в противовес dapi, который имеет синий цвет. Эта гистограмма количественно оценивает результаты вестерн-блоттинга в трех экспериментах, показывающие, что механическое растяжение увеличивает уровни белка С-поверхностно-активного вещества.

В этом эксперименте N равно трем, а звездочка указывает на значение P меньше 0,05. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как ускорить клетки легких плода и подвергнуть их механическому растяжению.