Экспериментальная система по изучению механотрансдукции в эмбриональные клетки легких

Целью данной процедуры является описание экспериментальной системы для изучения механической трансдукции в клетках плода легкого. Это достигается путем покрытия культуральных планшетов белками внеклеточного матрикса. Затем выделяют эпителиальные клетки второго типа легкого плода мыши, после чего проводят выделение фибробластов легкого плода мыши.

Заключительный этап описывает систему in vitro для обеспечения механической стимуляции клеток легких. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие усиление дифференцировки клеток второго типа, что подтверждается данными ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга и изображениями флуоресцентной иммуноцитохимии. Эти методы могут помочь в решении ключевых вопросов в области механотрансдукции, таких как развитие легких плода и повреждение легких.

Процедуру продемонстрирует Джулиан Гу, техник моей лаборатории. Работая в ламинарном шкафу в стерильных условиях, он приготовит 120 мкг ламинина, используя 12 мл холодного стерильного 1X PBS на одну планшету. Для покрытия можно использовать и другие белки внеклеточного матрикса. Подробности см. в письменном протоколе. Затем возьмите необработанный планшет BioFlex и добавьте по 2 мл раствора ламинина в каждую лунку до достижения конечной концентрации 2 мкг/см².

Убедитесь, что лунки полностью покрыты раствором. Плотно закройте планшет пищевой пленкой и оставьте на плоской поверхности при температуре 4 °C на ночь, чтобы ламинат впитался в дно лунок. Покрытые планшеты могут храниться в таких условиях не менее недели, сохраняя при этом функциональность ECM на следующий день.

В стерильных условиях трижды промойте лунки 1 XPBS. Затем добавьте в каждую лунку один миллилитр 1% BSA в 1 XPBS. Инкубируйте лунки при 37 °C в течение одного часа для блокирования сайтов неспецифического связывания на мембранах.

Затем снова трижды промойте лунки 1XPBS. Для удаления неабсорбированных белков добавьте в каждую лунку планшета по одному миллилитру DMEM. После этого храните планшет при 37 °C до тех пор, пока эпителиальные клетки второго типа легких плода грызуна не будут выделены и готовы к посеву.

За день до начала процедуры изоляции клеток соберите фильтрующие стаканы с нейлоновыми сетками с размером пор 130 и 15 микрон и стерилизуйте их в автоклаве. Также в день проведения культуры автоклавируйте такое же количество стеклянных стаканов объемом 150 миллилитров. Получите плоды легких от беременных мышей с сроком гестации от E 17 до 19.

Перенесите ткань в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую среду DMEA, и поместите ее на лед. Приготовьте свежий буфер для переваривания в центрифужной пробирке объемом 50 мл согласно рецепту, указанному в письменном протоколе. Работая в ламинарном шкафу, стерилизуйте буфер через шприцевой фильтр с порами 0,2 мкм.

10 миллилитров данного буфера достаточно для легочной ткани, полученной примерно от 20 плодов мышей. Поместите коническую пробирку с буфером для переваривания в водяную баню при 37 °C. Извлеките плод из конической пробирки с тканью легких плода и перенесите ткань в стерильную чашку Петри с помощью стерильных ножниц или лезвия бритвы, измельчив ткань на кусочки размером менее одного миллиметра.

Затем перенесите ткань в коническую пробирку, содержащую предварительно подогретый буфер для дигестии. Далее облегчите механически процесс дигестии ткани, перенося суспензию клеток плода легкого пипеткой вверх и вниз по сто раз, используя пипетки с постепенно уменьшающимся диаметром отверстия. По завершении процесса дигестии центрифугируйте гомогенат при 1 300 RPM в течение пяти минут при комнатной температуре.

Затем аккуратно удалите супернатант путем аспирации и ресуспендируйте осадок, содержащий клетки, в 15 миллилитрах DMEM с добавлением 20% FBS. Далее возьмите фильтрующие стаканы с нейлоновыми сетками с размером пор 130 и 15 микрон и установите их сверху на стерильные стаканы объемом 150 миллилитров. Перенесите гомогенат клеток пипеткой на сетку с размером пор 100 микрон.

Соберите фильтрат и перенесите его пипеткой на сетку с размером пор 30 мкм. Несколько раз промойте сетку с размером пор 30 мкм свежей средой DMEM с добавлением 10% FBS. Большинство клеток второго типа агрегируют и не проходят через сетку.

Эти промывки удаляют неэпителиальные клетки, которые могут быть прикреплены к кластерам. Перенесите фильтрат с сетки 30 мкм в чашку с сеткой 15 мкм. Снова повторите промывку несколько раз, как и прежде.

На данном этапе выделяют клетки второго типа, которые могли пройти через сито с размером ячеек 30 мкм. Соберите скопления нефильтрованных клеток с сит 30 и 15 мкм для дальнейшего обогащения популяцией клеток второго типа. Сохраните фильтрат после прохождения через сито 15 мкм, если планируется культивирование фибробластов легких плода грызуна.

В противном случае этот фильтрат следует удалить. Далее, для очистки популяции эпителиальных клеток второго типа, добавьте среду и инкубируйте нефильтрованные клетки из чашек с сеткой 30 и 15 мкм в флаконе для культивирования тканей объемом 75 см² в течение 30 минут. После этой инкубации центрифугируйте супернатант, как описано ранее, удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 2 мл безсывороточного DMEM. Перенесите по 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку 6-луночного планшета BioFlex с ламинат-покрытием. На данном этапе при наблюдении под микроскопом клетки будут выглядеть в виде комков. Инкубируйте планшет в инкубаторе для культур тканей при 37 °C и 5% CO₂. Оптимальное время инкубации составляет 24 часа, минимальное — 6 часов.

Перед началом экспериментов по механическому растяжению возьмите фильтрат, полученный через сетку с размером ячеек 15 мкм, и перенесите его в флакон для культивирования тканей объемом 75 см² при 37 °C на 30–60 минут, чтобы дать фибробластам прикрепиться; затем аспирируйте и удалите супернатант. После этого замените объем жидкости во флаконе на безсывороточную среду DMEM и инкубируйте клетки в течение ночи. На следующий день соберите клетки с помощью 0,25% трипсина в 0,4 мМ EDTA и высейте их на планшеты BioFlex, покрытые фибронектином; инкубируйте в инкубаторе для культур тканей при 37 °C и 5% CO2, в идеале в течение 24 часов перед началом экспериментов по механическому растяжению.

Если для экспериментов требуется определенное количество клеток, необходима инкубация в течение минимум шести часов. Клетки второго типа поддерживают в колбах объемом 75 квадратных сантиметров с безсывороточной средой DMEM после изоляции, а на следующий день клетки подвергают трипсинизации, подсчитывают и высевают. Перед началом экспериментов степень слияния монослоя не должна превышать 80%. В день проведения эксперимента по механической стимуляции культуральную среду заменяют на 2 мл свежей безсывороточной среды DMEM на одну лунку, после чего планшет устанавливают в установку для растяжения Flexcell FX-5000.

Затем приложите к мембранам равноосное двуосное растяжение (EQU biaxial strain). Режим растяжения варьируется в зависимости от имитируемых механических сил in vivo. Как указано в письменном протоколе, клетки выращивали на растянутых мембранах без ST.

Параллельно культивируемые образцы используются в качестве контролей для эксперимента. По окончании эксперимента монослои можно подвергнуть обработке для анализа изменений в экспрессии генов с помощью ПЦР в реальном времени или изменений содержания белков методом вестерн-блоттинга. Кроме того, монослои можно зафиксировать для проведения иммунохимических исследований данным методом.

После фиксации апикальные мембраны вырезают из лунок и наносят на предметные стекла, используя от 10 до 20 µL воды в качестве закрепляющего агента, перед пермеабилизацией и инкубацией с антителами. Супернатант из эксперимента также может быть использован для исследования наличия высвобожденных веществ, таких как факторы роста или цитокины. На данном изображении представлены параформальдегид-фиксированные эпителиальные клетки II типа плода на стадии E 18, которые были выделены согласно данному протоколу и высеяны в лунки BioFlex, покрытые ламинином.

Клетки фиксировали и делали фотографию. На следующий день после растяжения без применения ST клетки высеяли. Чистота культуры клеток была определена как 90 ± 5% с помощью микроскопического анализа морфологии эпителиальных клеток и иммуноокрашивания на сурфактантный белок C. На следующих рисунках представлены данные для фетальных эпителиальных клеток второго типа, подвергнутых воздействию 5% циклической деформации с частотой 40 циклов в минуту в течение 16 часов.

Данный северный блот экспрессии мРНК сурфактантного белка C демонстрирует, что механическое растяжение индуцирует дифференцировку клеток второго типа при использовании различных субстратов ВКМ. Знаки плюс и минус обозначают воздействие растяжения и отсутствие воздействия растяжения соответственно. Данные об экспрессии представлены на гистограмме в виде среднего значения плюс или минус стандартная ошибка среднего (SEM), N равно трем, а звездочкой отмечено значение P менее 0,05.

На этих изображениях иммунофлуоресцентного анализа зеленым цветом показан уровень белка сурфактанта C. В клетках плода второго типа, которые не подвергались механическому воздействию (слева) и подвергались механическому воздействию (справа), ядра были подвергнуты контрастированию DAPI, который окрашен в синий цвет. Эта гистограмма количественно отображает результаты вестерн-блоттинга из трех экспериментов, показывая, что механическое растяжение повышает уровень белка сурфактанта C.

В данном эксперименте N равно трем, а звездочка указывает на значение P менее 0,05. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как культивировать клетки легких плода и подвергать их механическому растяжению.