Измененный Дрожжи-Two-гибридная система для идентификации белков Взаимодействие с фактор роста Progranulin

Данная система MY two H совершенствует стандартный протокол дрожжевой двугибридной системы для значительного снижения количества ложноположительных результатов. Сначала проведите маломасштабную трансформацию дрожжей плазмидой-приманкой. После валидации конструкции приманки с помощью скрининга с конкурентным ингибитором проведите скрининг библиотеки кДНК на средах без четырех основных компонентов (minus four plates).

Перейдите к верификации положительных клонов с помощью XGL и репортерных анализов. Затем идентифицируйте потенциальные взаимодействующие белки с помощью секвенирования ДНК и биоинформатического анализа. В конечном итоге, данная модифицированная система дрожжевой двухгибридной технологии значительно повышает эффективность и успех процесса скрининга.

Традиционная система дрожжевого двухгибридного анализа известна тем, что дает много ложноположительных результатов. В данном видео продемонстрирована модифицированная процедура скрининга, которая значительно более эффективна в плане выявления истинно положительных взаимодействий. Итак, приступим.

Инокулируйте 50 мл среды YPD 5 мл ночной культуры MAV 2 0 3. Культивируйте от двух до четырех часов при 30 °C. Затем соберите дрожжи центрифугированием, после одного промывания ресуспендируйте осадок в 2 мл раствора один и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.

Подготовьте смесь ДНК для трансформации. Добавьте 100 µL клеток дрожжей и тщательно перемешайте. Затем добавьте 700 µL раствора два и снова тщательно перемешайте.

Сначала инкубируйте при 30 °C в течение 30 минут, затем проведите тепловой шок. Теперь соберите клетки путем центрифугирования и ресуспендируйте осадок в 200 µL автоклавированной дистиллированной воды; высейте серийные разведения суспензии на чашки с SD LU и инкубируйте при 30 °C от двух до трех дней. Этот этап подтверждает, что приманка-плазмида активирует транскрипцию и что эта самоактивация может быть нейтрализована ингибиторами, такими как 3-амино-1,2,4-триазол, который является конкурентным ингибитором продукта гена HIS3.

Сначала проведите трансформацию дрожжей MAV 2 0 3 плазмидой-приманкой. Высейте реакционную смесь на чашки с среду SD LU и инкубируйте при 30 °C. Чтобы провести скрининг колоний на индуцированную самоактивацию 3-AT, с помощью автоклавированных зубочисток перенесите колонии из каждой трансформации на чашки с средой SD LU hiss, содержащей возрастающие концентрации 3-AT, и инкубируйте чашки при 30 °C.

Отсейте штаммы-приманки, которые растут на чашках с 100 мМ 3-AT, так как они непригодны для использования в двухгибридном скрининге для re. Для оставшихся приманок выберите минимальную концентрацию 3-AT, подавляющую рост клеток, для использования при скрининге библиотеки CD NA; суспендируйте несколько изолированных колоний дрожжей, содержащих плазмиду-приманку, в 100 µL автоклавированной дистиллированной воды. Рассейте их по двум чашкам SD LU диаметром 10 см.

Инкубируйте обе чашки при 30 °C. Соскребите и полностью суспендируйте клетки в 10 мл. Автоклавируйте дистиллированную воду и инокулируйте 500 мл жидкой среды YPD.

Проверьте плотность клеток с помощью спектроскопии, фотометрии и культивирования при 30 °C. Перейдите к сбору клеток путем центрифугирования. Промойте один раз в 100 мл автоклавированной дистиллированной воды и один раз в 50 мл раствора один.

Затем ресуспендируйте осадок в 2,5 миллилитрах раствора один. Теперь добавьте денатурированную фрагментированную ДНК спермы лосося, а также библиотеку cDNA, аккуратно перемешав содержимое пипетированием. Затем добавьте 15 миллилитров раствора два, содержащего 40% полиэтиленгликоля.

Осторожно перемешайте и разлейте по 700 µL в 25 автоклавируемые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл; инкубируйте в течение 30 минут в водяной бане при 30 °C, после чего проведите тепловой шок в течение 15 минут в водяной бане при 42 °C.

Соберите клетки путем центрифугирования, затем осторожно ресуспендируйте каждый осадок в 400 µL автоклавированной дистиллированной воды. Рассейте каждую трансформационную смесь на две селективные чашки и инкубируйте от 5 до 10 дней при 30 °C для контрольной оценки эффективности трансформации на реакционной чашке. Серийные разведения одной реакции.

После инкубации в течение трех дней при 30 °C определите общее количество колоний. Перенесите колонии на чашку с YPD-агаром и инкубируйте при 30 °C в течение ночи. Затем поместите круглую нитроцеллюлозную мембрану непосредственно на чашку с YPD-агаром, следя за отсутствием пузырьков воздуха.

Через минуту убедитесь, что все колонии перенесены на мембраны. Поместите мембрану стороной с колониями вверх в лодочку из алюминиевой фольги и положите её на поверхность жидкого азота на 20 секунд. Затем погрузите мембрану в жидкий азот на несколько минут.

Теперь извлеките мембрану для размораживания. Тем временем подготовьте чашку Петри со слоем свежего раствора XCA на фильтровальной бумаге Whatman. Затем осторожно погрузите размороженную мембрану и инкубируйте при 37 °C.

До появления синих колоний. Реакция добычи, клонов и приманки, сконструированных в дрожжах, может дополнительно исключить ложноположительные результаты. Сначала выделите плазмидную ДНК из штаммов дрожжей, потенциально содержащих взаимодействующие белки.

Трансформируйте ДНК в клетки E. coli DH5α и проведите селекцию путем культивирования на чашках с LB-агаром и ампициллином. Проскринингуйте трансформанты с помощью анализа с использованием рестриктаз. Затем проведите ко-трансформацию плазмид «жертвы» (prey) и «приманки» (bait) в дрожжи MAV203, высейте их на чашки SC-Leu-Trp и инкубируйте в течение двух-трех дней при 30 °C.

Выберите три разные колонии для проведения последовательности анализа xal, выделите плазмидную ДНК из положительных клонов и идентифицируйте гены с помощью биоинформатики. В данном эксперименте в качестве приманки для скрининга библиотеки кДНК мозга использовался фактор роста Rine pro Granulin, в результате чего было получено 54 положительных клона.

Кандидаты были выделены из 2,5 миллионов трансформантов, прошедших скрининг с использованием приманки к програнулину. Последующий анализ с помощью метода ex skull выявил 23 положительных клона-кандидата для приманки к програнулину.

Интересно, что биоинформатический анализ данных секвенирования выявил TNF R2. Действительно, последующие функциональные эксперименты подтвердили, что програнулин является новым лигандом рецепторов TNF. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить этот модифицированный гибридный скрининг с использованием интересующего вас белка.

Не забудьте работать в перчатках, так как некоторые используемые реагенты опасны. Желаем успехов в ваших экспериментах.