Выделение мышиные клетки легких Дендритные

Общая цель данной процедуры — получение высокоочищенной подготовки дендритных клеток легкого мыши. Для этого сначала собирают ткань легкого, не включая дренирующие лимфатические узлы. Затем с помощью коллагеназного переваривания получают суспензию одиночных клеток.

Следующим шагом является обогащение популяции CD 11 C-положительных клеток с помощью системы магнитного выделения клеток. Затем с помощью проточной цитометрии выделяют подмножество конвенциональных дендритных клеток. В итоге конвенциональные дендритные клетки, выделенные из легочной ткани мыши, можно проанализировать с помощью проточной цитометрии и световой микроскопии.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как: какова роль обычного подмножества дендритных клеток в обеспечении врожденного иммунитета и развитии инфекционных заболеваний дыхательных путей? Процедуру продемонстрируют Исса Ланселин, научный сотрудник моей лаборатории, и я сам. После эвтаназии мыши начните с разреза и осторожного раздвигания кожного покрова брюшной полости, чтобы открыть доступ к грудной полости.

Переходите к вскрытию диафрагмы, разрезав грудную клетку, чтобы обнажить сердце и легкие. После того как сердце и легкие будут обнажены, можно начинать процедуру перфузии. Наберите в шприц объемом 5 мл раствор E-D-T-A-H-B-S-S и прикрепите к шприцу иглу 25-го калибра.

Затем введите иглу в правый желудочек, чтобы предотвратить утечку во время инъекции. Используйте пинцет, чтобы зафиксировать ткани миокарда вокруг иглы. После этого осторожно введите раствор, поддерживая постоянное давление.

Правильная перфузия приведет к расправлению легких и изменению их цвета на розовый или белый; чтобы избежать возможного загрязнения, удалите и утилизируйте дренирующие лимфатические узлы. Затем соберите ткань легких, перенеся иссеченный орган в чашку Петри на льду. Наполните трубку GentleMax C пятью миллилитрами раствора для коллагеназного переваривания легких, после чего измельчите легкое на мелкие кусочки.

С помощью лезвия бритвы перенесите ткань в пробирку, используя режим бережной максимальной диссоциации (gentle max dissociation). Для получения суспензии единичных клеток выберите программу M lung zero one. Затем инкубируйте образец при 37 °C в течение 30 минут, встряхивая пробирку каждые пять минут для ресуспендирования фрагментов ткани, после чего перейдите к программе M lung zero two.

Теперь перенесите образец в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клетки в течение 10 минут при 335 ×g и температуре 4 °C. Удалите супернатант и добавьте к осадку 2 мл буфера для лизиса CK на одну минуту при комнатной температуре, чтобы лизировать оставшиеся эритроциты. Затем промойте клетки 13 мл холодного PBS с добавлением 0,5% BSA.

После удаления супернатанта снова ресуспендируйте этот осадок в пяти миллилитрах холодного PBS с добавлением BSA, затем пропустите клеточную суспензию через нейлоновый фильтр с размером ячеек 100 мкм. В завершение определите общее количество клеток методом исключения трипанового синего. Вместо использования GentleMacs Dissociator, наполните коническую пробирку объемом 15 мл раствором коллагеназы из расчета пять миллилитров на одно легкое.

Поместите измельченную ткань легкого в пробирку и инкубируйте ее в течение одного часа при 37 °C. Каждые 15 минут перемешивайте содержимое на вортексе, чтобы привести фрагменты ткани в движение. Затем гомогенизируйте ткань, пропустив образец шесть-восемь раз через шприц объемом 3 мл, оснащенный иглой 20G.

Избегайте образования пузырьков в процессе выполнения. Сначала промойте суспензию одиночных клеток, центрифугируя ее в течение 10 минут при 200 ×g и температуре 4 °C, после чего удалите супернатант. Затем повторно суспендируйте клетки в 400 µL буфера для разделения.

Для предотвращения неспецифического связывания антител, опосредованного Fc-рецепторами, добавьте 0,5 мкг антител anti-CD163 к 10^8 клеток в общей сложности; инкубируйте клетки в течение 30 минут при температуре 4 °C. После промывки клеток 10 мл холодного разделяющего буфера повторно суспендируйте клетки в 400 мкл разделяющего буфера. Затем добавьте 100 мкл микросфер CD11c к 10^8 клеток в общей сложности, тщательно перемешайте и инкубируйте смесь клеток и микросфер в течение 15 минут в холодильнике.

После удаления несвязанных бусин 10 миллилитрами холодного разделяющего буфера удалите супернатант и повторно суспендируйте осадок клеток в одном миллилитре холодного разделяющего буфера. Наконец, загрузите образцы в сепаратор AutoMax pro и запустите программу P-O-S-S-E-L-D для сбора фракции клеток, экспрессирующих CD 11 C.

Инкубируйте обогащенную суспензию CD 11 C положительных клеток с антителами anti CD 11 C PEI семь и антителами к молекулам MHC класса II, присутствующим на этих клетках, в течение 30 минут при температуре четырех градусов Цельсия. После промывки клеток холодным PBS с BSA снова ресуспендируйте клетки в 0,5 миллилитрах PBS с BSA и пропустите их через нейлоновый сетчатый фильтр с размером пор 40 микрометров. В завершение перенесите очищенные CD 11 C положительные клетки в пробирку для FACS-анализа для последующего количественного определения в отдельных пустых пробирках.

Добавьте 100 µL PBS с BSA в пробирки для сбора объемом пять миллилитров, чтобы предотвратить повреждение очищенных клеток, и проведите сортировку отфильтрованной клеточной суспензии; на протяжении всего процесса сортировки поддерживайте собранные клетки при температуре охлаждения. На данных графиках плотности количество конвенциональных дендритных клеток в селезенке более чем в три раза превышает их количество в легком. Кроме того, CD 11 C-положительные клетки в легком включают популяцию клеток, не являющихся конвенциональными дендритными клетками, что представлено группой событий с низким уровнем экспрессии MHC Class two за пределами гейта конвенциональных дендритных клеток.

На левой стороне рисунка, представленном в виде этой плот-диаграммы плотности, видно, что магнитная сепарация всех клеток легких по маркеру CD11c увеличивает число конвенциональных дендритных клеток с примерно 1,5% от общего количества клеток до примерно 16,5%. Однако CD11c-положительные MHC Class II low макрофаги по-прежнему составляют более 70% от общей популяции клеток, что существенно снижает чистоту обогащенного подмножества конвенциональных дендритных клеток легких на данном этапе процесса изоляции. Сортировка с помощью FACS, однако, повышает чистоту конвенциональных дендритных клеток до более чем 96%, что видно на микрофотографии в верхнем правом углу. CD11c high MHC Class II high конвенциональные дендритные клетки представляют собой округлые клетки с типичными дендритами, тогда как CD11c high MHC Class II low клетки, показанные на микрофотографии в нижнем правом углу, имеют клеточные выросты, более характерные для морфологии макрофагов.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости работы с легочной тканью и суспензией единичных клеток при указанных температурах. Это имеет решающее значение для сохранения жизнеспособности клеток и обеспечения стандартного выхода дендритных клеток. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать субпопуляции дендритных клеток из легких мыши.

Изоляция подмножеств дендритных клеток легких представляет собой весьма полезный инструмент для изучения функций этих клеток в ответ на воздействие респираторных патогенов и факторов окружающей среды, способных вызвать иммунный ответ организма в легких.