Измерение пептида транслокации в Большой однослойные везикулы

Для количественного определения транслокации пептидов через мембраны везикул. Создаются флуоресцентно меченые липидные везикулы с инкапсулированным трипсином. Добавляют ингибитор трипсина для подавления активности любого экзогенного трипсина, чтобы активный трипсин оставался только в просвете везикул.

Только при добавлении флуоресцентно меченных пептидов к везикулам их флуоресцентные метки начинают работать как доноры FRET и возбуждать флуоресцентные молекулы на везикуле. Однако при прохождении белков через мембрану они подвергаются расщеплению трипсином, и сигнал FRET теряется. Спектрометрический анализ позволяет определить степень транслокации пептидов, которая проявляется как снижение уровня FRET между везикулами и пептидом с течением времени.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с другими подходами, включая иные методы работы с липидными везикулами и способы измерения проникновения пептидов в клетки, является то, что он позволяет получить информацию о кинетике проникновения через мембрану и не требует добавления флуоресцентной метки к пептидам, если они содержат триптофан. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы при проектировании и инженерии мембраноактивных пептидов, например, о том, какие характеристики необходимы для эффективной мембранной транслокации. Первым этапом данной процедуры является приготовление больших однослойных липидных везикул (UUV), которые будут служить имитаторами клеточных мембран для анализа.

Начните с объединения фосфатидилхолина, фосфатидилглицерола и пяти диметиламинонафталин-1-сульфонилфосфатидилэтаноламина в хлороформе. В соотношении 50:45:5 обычно достаточно 0,376 мг общего количества липидов для приготовления достаточного объема везикул для одного экспериментального или контрольного опыта.

Подготовьте одну пробирку в качестве экспериментального образца и одну в качестве контроля; выпарите хлороформ, используя поток азота. Высохшие липиды, остающиеся после этого этапа, называют липидными лепешками. Сушите липидные лепешки от 9 до 14 часов в вакуумном эксикаторе.

Затем приготовьте 10 мМ стоковый раствор HEI, 0,4 мМ стоковый раствор трипсина из свиных семенников и 4,0 мМ стоковый раствор ингибитора трипсина Боумена-Бёрка; подробную инструкцию по приготовлению можно найти в сопроводительном документе. Добавьте равный объем 0,4 мМ стокового раствора трипсина и 10 мМ буферного раствора HEI к высушенным липидным лепешкам. Затем перемешайте содержимое пробирки на вортексе для реконструирования многоламеллярных везикул (MV). Для реконструирования контрольных MV добавьте к высушенной липидной лепешке равный объем 0,4 мМ стокового раствора трипсина и 4,0 мМ стокового раствора ингибитора трипсина, после чего, как и прежде, перемешайте на вортексе.

После реконструирования mvs перенесите растворы MLV из стеклянных флаконов в микроцентрифужные пробирки объемом 1.7 миллилитра. Затем подвергните растворы MLV пяти циклам замораживания-оттаивания, чередуя жидкий азот и водяную баню при температуре 30 °C. Далее подготовьте липидный экструдер, увлажните две фильтрующие подложки буфером Хейсса.

Затем поместите каждую из них на увлажненный фрагмент тефлонового экструдера и установите мембрану с трековыми порами размером 0.1 micron между двумя фрагментами тефлонового экструдера. Теперь поместите фрагменты экструдера в металлический корпус экструдера и установите кольцевой проставочный диск поверх обоих фрагментов экструдера. Затяните металлическую верхнюю часть корпуса экструдера, а затем установите его в держатель, используя стеклянный шприц объемом 250 microliter.

Заполните полость экструдера 500 µL 10 мM HEPES-буфера, чтобы предотвратить потерю образца везикул. Перенесите образец в стакан объемом 10 мл.

Затем поместите каждый образец MLV в экструдер и пропустите образец через мембрану не менее 21 раза. Чтобы обеспечить однородный размер везикул Ella после экструзии, перенесите крупные липидные везикулы ELLA или L UUV в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл. Храните UUV при температуре four degrees Celsius и используйте их в течение 48 часов.

Для оценки концентрации LUV определяют общее содержание фосфора в образце. Следующее необходимо подготовить в соответствии со спецификациями, указанными в прилагаемом письменном протоколе: 8,9 н. H₂SO₄, 2,5% (масс./об.) молибдат аммония, 10% (масс./об.) аскорбиновая кислота и 0,65 мМ фосфатный буферный раствор.

Подготовьте шесть стандартов фосфора, как показано здесь. Затем приготовьте холостую пробу LUV, используя тот же объем 0.2 millimolar раствора трипсина и 2.0 millimolar раствора ингибитора Bowman BIR, что и для контрольных образцов. Это необходимо для коррекции содержания любых высохших солей фосфора в порошке ингибитора Bowman B.

Затем перенесите пипеткой примерно 0,1 мкмоль (обычно около 25 µL) UUVs в одноразовые стеклянные культуральные пробирки в трех повторностях. Далее добавьте 450 µL 8,9 N H₂SO₄ в каждую из пробирок с образцами, стандартами и холостой пробой. Затем поместите образцы, стандарты и холостые пробы в печь при температуре от 175 до 210 °C на 25 минут.

По истечении 25 минут извлеките все пробирки из печи и дайте им остыть. Добавьте в каждую пробирку 150 µL 30% H2O. Затем нагревайте образцы, стандарты и холостые пробы еще в течение 30 минут при температуре от 175 до 210 °C.

Через 30 минут снимите стандарты образцов и холостые пробы с нагрева. Если какие-либо из растворов всё еще не обесцветились, добавьте в каждую пробирку по 50 µL H2O и нагревайте еще 15 минут при температуре от 175 до 210 °C. После того как растворы станут бесцветными, добавьте в каждую пробирку 3,9 мл сверхчистой воды (nano pure H2O), 0,5 мл раствора молибдата аммония и 0,5 мл раствора аскорбиновой кислоты.

Затем прогрейте все пробирки в течение пяти-семи минут. В кипящей водяной бане измерьте абсорбцию каждого стандарта и образца при 820 нанометрах, используя УФ-видимый спектрофотометр Agilent 8 4 5 3. Концентрации LUV в экспериментальных и контрольных группах должны измеряться раздельно.

Пробирку, содержащую 0,0 ммоль фосфора, следует использовать в качестве холостой пробы для всех стандартов и экспериментальных образцов LUV. Пробирку, содержащую 0,2 мМ трипсина и 2,0 мМ раствора ингибитора кости и бир, следует использовать в качестве холостой пробы для контрольного образца LUV. Построенный линейный график зависимости абсорбции от содержания фосфора (калибровочная кривая) следует использовать для расчета общего содержания фосфора и концентрации LUV в образцах.

Для приготовления пептидных растворов растворите пептид в Oppu H2O; пептиды, используемые в данном анализе, должны содержать один остаток триптофана. Измерьте абсорбцию раствора пептида при 282 нанометрах в трех повторностях. Рассчитайте концентрацию пептида, используя молярный коэффициент экстинкции для триптофана, равный 5 700.

Разбавьте пептид в воде Nano Pure до конечной концентрации 30 µM и храните при -20 °C. Для количественной оценки транслокации подготовьте экспериментальные и контрольные образцы в микроцентрифужных пробирках объемом 1,7 мл. Добавьте в каждый раствор достаточное количество UUV для достижения конечной концентрации 250 µM.

Добавьте достаточное количество раствора ингибитора Bowman BIR, чтобы конечная концентрация ингибитора была в 10 раз выше концентрации трипсина. Добавьте 10 мМ буфер Хеиса, чтобы довести конечный объем раствора до 450 мкл. Перенесите 50 мкл раствора пептида в кювету для флуориметра Stana micro chords и поместите ее в спектрофотометр согласно программе.

Флуоресцентный спектрофотометр для проведения 25-минутного эксперимента по кинетике флуоресценции, при котором показания флуоресценции регистрируются не реже одного раза в секунду при длине волны возбуждения 280 нм и длине волны испускания 525 нм при температуре 25 °C. Установив высокую чувствительность ФЭУ, добавьте экспериментальный или контрольный образец в раствор пептида в кювете. Конечная концентрация пептида должна составить 3 мкМ; немедленно начните эксперимент по кинетике флуоресценции.

После проведения анализа как экспериментальных, так и контрольных образцов рассчитайте коэффициенты транслокации согласно описанию в сопроводительном документе. Соотношение между данными и пептидом достаточно высоко, чтобы гарантировать, что практически все неповрежденные пептиды находятся в достаточной близости к группе dansel для возникновения сигнала FRET, даже если ни один из них не транслоцировался в везикулу. Это согласуется с аналогичными значениями FRET, наблюдаемыми в контрольных условиях для пептидов, которые транслоцируются в везикулы, и тех, которые этого не делают.

Анализы транслокации проводили согласно описанию в данном видео. На этом рисунке представлены результаты для репрезентативного пептида, который продемонстрировал выраженную транслокацию. Сигнал в этом эксперименте, обозначенный черной линией, показывает заметное снижение сигнала FRET.

Со временем более высокие коэффициенты транслокации указывают на пептиды, которые эффективно транслоцируются. Коэффициент транслокации для показанных здесь細胞-проникающих пептидов составляет 1,19; еженедельно транслоцирующиеся пептиды имеют коэффициенты транслокации, близкие к единице, для контроля потенциальной потери сигнала FRET из-за неполного переваривания трипсином или ингибирования, а также других факторов, не связанных со способностью к транслокации. Измеряется сигнал FRET между пептидом и UUV, содержащими как трипсин, так и ингибитор трипсина Боумена-Биркмана.

Это показано серой кривой. Важность контрольного эксперимента с использованием UUV, содержащих ингибитор трипсина, подчеркивается представленными здесь данными. В данном случае сигнал пептида снизился на величину, аналогичную той, что была наблюдается на предыдущем рисунке для экспериментального образца, представленного черной кривой.

Однако в контрольном образце наблюдается более быстрое снижение для этого пептида, поэтому его чистая транслокация ниже. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как создавать липидные везикулы и измерять транслокацию пептидов, содержащих триптофан. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости начать сбор данных сразу после смешивания пептида и везикул.