Оценка соматических Hypermutation в Рамос-клеток после Сверхэкспрессия или Нокдаун специфических генов

Общая цель следующего эксперимента заключается в изменении экспрессии определенного гена с последующей оценкой его влияния на соматическую гипермутацию. Это достигается путем трансфекции клеток Bosque 23 для получения вирусных частиц, содержащих либо конструкцию для гиперэкспрессии, либо конструкцию, содержащую SHRA. На втором этапе клетки ramo заражают полученными вирусами, что приводит к нокдауну или гиперэкспрессии интересующего гена.

Затем клоны единичных клеток выращивают в течение нескольких недель, чтобы дать клеткам возможность накопить мутации. Наконец, эффект измененной экспрессии генов можно определить на основании анализа потери IgM и путем секвенирования генов IG. Данный метод может помочь в выявлении новых факторов, участвующих в диверсификации антител.

Начните с того, что отмерьте 600 µL подогретого DMEM в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл. Затем, осторожно дозируя жидкость непосредственно в среду, добавьте в пробирку 30 µL FUgene 6; перемешайте раствор на вортексе менее одной секунды, после чего инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее, для проведения лентивирусного заражения, подобного данному, добавьте в смесь DMEM и FUgene 6 6 µg конструкции shRNA, а также по 1.5 µg pVSV-G-pMDL-G-pRR-E и pRSV-rev.

Кратковременно перемешайте раствор на вортексе, а затем снова инкубируйте при комнатной температуре, на этот раз в течение 25 минут. Наконец, трансфицируйте культуру клеток Bosque 23 с конфлюэнтностью 50–60% с помощью комплекса ДНК-DMEM. Перемешайте и инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 часов.

На следующий день добавьте к клеткам 5 мл DMEM и верните их в инкубатор еще на 24 часа. На третий день после трансфекции с помощью шприца объемом 10 мл соберите 10 мл среды из лунки с трансфицированными клетками, затем установите на конец шприца фильтр с порами 0,45 мкм. Соберите отфильтрованную среду в чистую полипропиленовую пробирку объемом 15 мл. За 24 часа до инфицирования высейте в шестилуночный планшет в полную среду RPMI клетки RAMO из расчета 2 × 10⁵ клеток/мл в объеме 2 мл на лунку. На следующий день добавьте к клеткам RAMO 3 мкл раствора полибрена в концентрации 10 мкг/мл и 1 мл вируса, после чего тщательно перемешайте клеточную суспензию путем пипетирования.

Для неинфицированного контроля в одну из лунок вместо вируса добавьте один миллилитр полной среды RPMI и три микролитра гомогената головного мозга. Также инфицируйте одну лунку соответствующим отрицательным контролем, а другую — вектором, содержащим GFP, для определения эффективности инфекции с помощью FACS. Затем центрифугируйте планшет на шесть лунок при 3000 ×g в течение 90 минут при комнатной температуре, после чего верните планшет в инкубатор на 48 часов.

Наконец, центрифугируйте инфицированные клетки в 15-миллилитровой полипропиленовой пробирке при 400 Gs в течение четырех минут. При комнатной температуре аспирируйте среду, стараясь не повредить клеточный слой, и ресуспендируйте клетки в свежей среде RPMI. После подсчета клеток доведите концентрацию инфицированных клеток RAMO до 10 клеток на миллилитр.

В раствор из кондиционированной среды RPMI и FBS до конечного объема 10 миллилитров для каждой посеваемой планшетки. Затем с помощью многоканального дозатора посейте клетки в 96-луночные планшетки, добавляя по 100 µL разведенного клеточного суспенза в каждую лунку.

После инкубации планшетов в течение 24 часов при 37 °C и 5% carbon dioxide осмотрите каждую лунку с помощью микроскопа. Это необходимо для подтверждения наличия клеток, так как подобрать правильную глубину фокуса для идентификации одиночных клеток может быть затруднительно. Сначала попробуйте сфокусироваться на номерах лунок, нанесенных на дно 96-луночного планшета.

Затем через две недели попытайтесь найти клетки. Проверьте наличие клеточных колоний вдоль краев лунок, используя перманентный маркер. Отметьте лунки с активным ростом клеток, после чего перенесите колонии в 24-луночные планшеты в 1 мл RPMI для дальнейшего инкубирования.

После нескольких дней роста перенесите клетки в планшет на шесть лунок и продолжайте инкубацию культур. Через три недели после высева клеточных колоний в шестилуночный планшет перенесите 5 × 10⁵ клеток из каждой лунки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. В это же время соберите клетки из каждой из лунок контроля и лунок с нокдауном HRNA, а также один образец для неокрашенного контроля.

Теперь центрифугируйте все клетки при 400 Gs в течение четырех минут при комнатной температуре, дважды промыв клетки одним миллилитром PBS при втором осаживании. После второй промывки мы суспендируем осадок неокрашенного контроля в 50 µL PBS, а остальные осадки — в PBS с добавлением антител к человеческому IGM, меченных PE, в разведении 1:20. Затем инкубируйте все образцы клеток на льду в течение одного часа. После этого промойте клетки еще два раза с помощью PBS, как и ранее, удалите супернатант и ресуспендируйте все осадки в 100 µL PBS.

Затем перенесите ресуспендированные окрашенные и контрольные неокрашенные клетки в пробирки FACS и проведите анализ клеток методом проточной цитометрии. Сравните процент IgM-отрицательных клеток в контроле и в клетках с нокдауном S-H-R-N-A. Ретровирусный вектор для сверхэкспрессии ID был трансфицирован в клетки Bosque 23.

Затем вирусы собирали и использовали для заражения клеток Ramos — как дикого типа (wt), так и клеток с гиперэкспрессией AID (AID.High). Клетки высаживали в единичных концентрациях и культивировали в течение трех недель, после чего анализировали экспрессию генов с помощью количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). Как и ожидалось, результаты RT-qPCR показали заметное увеличение экспрессии AID после заражения клеток вектором для гиперэкспрессии AID. Потеря IgM в зараженных клетках также оценивалась методом проточной цитометрии (FACS). Поверхностный IgM измеряли методом FACS через три недели (как показано на предыдущем рисунке); для клеток дикого типа и клеток AID.High рассчитывали процент потери IgM и представляли в виде графика. Согласно ожиданиям, клетки с гиперэкспрессией AID демонстрировали более выраженную потерю поверхностного IgM.

В отдельном эксперименте в клетках bosque 23 были созданы лентивирусы, содержащие либо нерелевантную S-H-R-N-A в качестве контроля, либо S-H-R-N-A против фактора высокоточной репарации ДНК, который, как ожидалось, обеспечивает защиту от SHM. Затем этими лентивирусами были заражены клетки клона Ramos с высоким уровнем ID. Снова был проведен анализ экспрессии генов, и, как и ожидалось, в присутствии таргетной S-H-R-N-A против этого фактора наблюдалось снижение уровня соответствующего фактора репарации ДНК. Также через три недели был проанализирован уровень потери IGM в одиночных клеточных клонах; поскольку считается, что данный фактор репарации обеспечивает защиту от мутаций во время SHM, в его отсутствие происходит увеличение потери IGM и SHM, что можно наблюдать на данном рисунке.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить вирусное заражение клеточной линии B-клеток нативными образцами с использованием конструктов для ОВЕРЭКСПРЕССИИ или S-H-R-N-A, а затем измерять уровень соматической гипермутации в этих клетках.