Альгината микрокапсулы в качестве 3D-платформа для распространения и дифференциации эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) для разных линий

Этот протокол оптимизирован для инкапсуляции плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека и их дифференцировки в дофаминергические нейроны в 3D-системе. Сначала обработайте колонии ингибитором горных пород или RI и соедините их в одиночные клетки с акуатом, смешанным с альгинатом натрия и пропущенным через устройство для инкапсуляции. Продолжайте лечение RI в течение трех дней, перенесите инкапсулированные клетки в клетки PA six и дифференцируйте в течение 28 дней.

В конечном счете, анализ экспрессии генов и белков показывает более высокую эффективность генерации дофаминергических нейронов. Основное преимущество этой конкретной методики по сравнению с существующим протоколом 2D-дифференцировки заключается в том, что мы пытаемся размножать и дифференцировать эти клетки в 3D-среде, и эта 3D-среда дает вам возможность размножать клетки с высокой плотностью. И тогда это также дает возможность иметь лучшее взаимодействие между клетками для дифференцировки.

И, в-третьих, это также даст вам лучшую эффективность дифференциации в дальнейшем. И еще, если позволите, я добавлю, что эта конкретная техника также может быть адаптирована для других типов клеток, которые мы можем размножать в 3D-среде. Теперь вспомните также, как, например, что этот конкретный метод был оптимизирован на основе использования определенного ингибитора горных пород, который предотвращает апоптоз клеток, а также предотвращает отделение клетки от культуральных чашек.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, поначалу будут испытывать трудности, поскольку этот метод обычно не применяется в культуре тканей. Приведенный ниже метод инкапсуляции был оптимизирован на основе кратких исследований д-ра Дина д-ра Чада по применению типа ингибитора R в альгинате, концентрации альгината и настройкам устройства для инкапсуляции. Джейми и Ким, аспирант из нашей лаборатории, теперь продемонстрируют этот протокол.

Добавьте 25 миллилитров стерильного 0,1%-ного раствора желатина к 275 миллиграммам очищенного альгината натрия в стерильном вихре объемом 50 миллилитров для частичного растворения порошка альгината. Затем поместите трубку на орбитальный миксер при 10-кратном перегрузке на ночь. Далее добавьте в раствор альгината 9%-ный стерильный хлорид натрия.

Сделайте вихрь в течение 30 секунд, а затем центрифугируйте при 95-кратном перегрузке в течение пяти минут. Храните раствор альгината при температуре четыре градуса Цельсия. Сначала в темноте предварительно обработайте эмбриональные стволовые клетки человека питательными средами с добавлением 10 микромолей ингибитора горных пород.

Выдерживать в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Теперь дважды промойте клетки DPBS, чтобы выбить клетки ферментативным путем. Добавьте аккутан и выдерживайте 10 минут.

При температуре 37 градусов Цельсия аккуратно соберите клетки скребком для клеток и переложите в 15-миллилитровую пробирку. Нейтрализуйте Аккутан равным объемом среды SL. Затем пропустите нейтрализованные клетки через фильтр 40 микрон в свежую центрифугу объемом 50 миллилитров

Теперь используйте гемоцитометр для подсчета клеток. Гранулируйте клетки методом центрифугирования, тщательно выбросьте супинат. Затем промойте ячейки один раз с предварительным подогревом.

0,9% натрия хлорид. Центрифугируйте усиление и выбросьте супинат. Чтобы инкапсулировать человеческие эмбриональные стволовые клетки, начните с суспензии клеток с предварительно подогретым раствором альгината.

Для этого к мягкой пластиковой трубке приложите шприц объемом 20 миллилитров и аспирируйте в шприц альгинат. Затем аккуратно перемешайте клеточную суспензию с помощью шприца, не создавая пузырьков. Теперь аспирируйте клетки в шприц.

Выбросьте пластиковую трубку, а затем прикрепите шприц к машине для герметизации. Приступайте к настройке приборов: генератора шариков, шприцевого насоса, расходомера воздуха и ванны для осаждения хлорида кальция. Проверьте зазор в 10 сантиметров между торцом машины для инкапсуляции и точкой сбора чашки Петри.

Далее установите шприцевую помпу на 10 миллилитров в час. Расход воздуха составляет восемь литров в минуту и давление 100 килограмм паскалей. Соберите инкапсулированные клетки в предварительно теплую ванну для осаждения на семь минут.

Затем переложите их с помощью щадящей аспирации в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 20 миллилитров 0,9% хлорида натрия, дайте капсулам осесть на дно пробирки, аккуратно выбросьте супинат, затем промойте один раз 0,9% хлорида натрия. Продолжайте ресуспендировать инкапсулированные клетки в предварительно прогретой питательной среде, дополненной ингибитором породы. Переложите в колбу для культуры и выдержите в течение трех дней.

Засейте шесть клеток стромальной линии мыши PA в колбу T 75, покрытую 0,1% желатином, и кондиционируйте дофаминергическую среду для нервной дифференцировки в течение 24 часов. Переложите капсулы в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и дайте им осесть на дно пробирки. Отбросьте супинат и ресуспендируйте капсулы в состоянии дофаминергической нервной дифференцировки при ПА шести клетках.

Среднекультурный. Инкапсулированные эмбриональные стволовые клетки человека с шестиклеточным монослоем PA в течение 21 дня. При пополнении носители меняются.

Только половина сред каждый раз продолжает культивировать шесть клеток PA в дофаминергической нервной дифференцировке. Среда дополнена индукционными факторами в течение одной недели. Сначала отсадите капсулы и переложите их в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Когда капсулы осядут на дно, выбросьте супинат. Дважды постирайте DPBS, выбросив супинат. Затем добавьте пять миллилитров обезглавливающего раствора и тщательно перемешайте суспензию.

Выдерживать в течение пяти минут комнатной температуры. После центрифугирования гранул ячейки для снятия крышек и дважды промывки DPBS продолжают использовать ячейки для снятия крышек либо в качестве монослойной культуры, либо для немедленного последующего анализа. В обычном препарате диаметр альгинатных микроколпачков составляет от 400 до 500 микрон.

Здесь проводится анализ C-F-D-A-P-I. Результаты определяют зеленые жизнеспособные инкапсулированные клетки на 80%Анализ жизнеспособности, пролиферации и апоптоза инкапсулированных эмбриональных стволовых клеток человека в разные моменты времени служит для оптимизации условий культивирования. Интересно, что эффекты ингибитора горных пород предотвращают апоптоз, индуцированный диссоциацией, и поддерживают жизнеспособность клеток, что указывает на превосходный рост инкапсулированных эмбриональных стволовых клеток человека, культивируемых в H-F-F-C-M плюс ri.

В этом примере инкапсуляция клеток используется в качестве 3D-платформы для дифференцировки инкапсулированных эмбриональных стволовых клеток человека в дофаминергические нейроны. Как и ожидалось, размер тел эмбриона увеличивается со временем после капсуляции dec, клетки демонстрируют прогрессирующую морфологию нейронов после двух-трех дней культивирования с жизнеспособностью более 90%. Анализ экспрессии генов указывает на подавление плюрипотентного маркера OCT 4.

Важно отметить, что нейропрогениторный маркер PAC six и дофаминергический нейронный маркер th остаются повышенными после семи дней дифференцировки. Дальнейшие дифференцированные эмбриональные стволовые клетки человека показывают более 90% положительных нейронов через 21 день. Западный анализ потерь подтверждает благоприятные паттерны экспрессии TH и PAC шести в 3D и 2D системах клеточных культур.

После освоения этой техники ее можно эффективно выполнить уже через два часа. Не забывайте обрабатывать клетки ингибитором горных пород до и после инкапсуляции. Индукторы или ингибиторы вариантов могут адаптировать протокол 3D-дифференцировки для будущих экспериментов.

Это конкретная техника инкапсуляции ESL человека и их дифференцировки в 3D-среде или для потенциала клеточной терапии ряда заболеваний, в частности болезни Паркинсона.