Производство тканей Microarrays, иммуногистохимического окрашивания и цифровизации В правам Атлас белка

Общая цель данной процедуры заключается в использовании эффективного метода для одновременного получения данных об экспрессии белков в нескольких типах тканей в рамках высокопроизводительного проекта, такого как Атлас белков человека. Это достигается путем предварительного выбора репрезентативных участков формалиново-фиксированных тканей, залитых парафином. Затем из отмеченных областей вырезаются образцы (керны), которые объединяются в один общий парафиновый блок — тканевый микромассив.

Затем из ТМА делают срезы и проводят иммуногистохимический анализ. В завершение анализируют паттерн экспрессии белка, и данные публикуются в атласе белков человека (Human Protein Atlas). В конечном итоге с помощью тканевых микромассивов и иммуногистохимии можно получить результаты, демонстрирующие экспрессию белков в тканях и клетках.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как проведение иммуногистохимического анализа с использованием цельных блоков паренхимы ткани, является возможность сохранения ценного биологического материала и более высокая воспроизводимость экспериментов. Еще одним преимуществом данной техники является сокращение затрат на ENT, а также времени лабораторной обработки. Эту процедуру по получению стандартной длины тканевых кернов продемонстрирует Ян Колл Бей, лаборант из моей лаборатории.

Сделайте метку на стилете. Рекомендуется оставить поля от 2,5 до 3,0 мм с каждой стороны парафинового блока, чтобы избежать растрескивания парафина при установке соответствующих высечек. Ослабьте винты с внутренним шестигранником, фиксирующие высечку, и расположите её так, чтобы паз в ступице высечки плотно прилегал к металлическому стержню в пластиковом V-образном блоке.

Затяните винты, убедившись, что край металлического зажима расположен горизонтально. Вставьте пробойник для реципиента слева, а пробойник для донора справа. Используйте ручки регулировки XY и соответствующие цифровые микрометрические индикаторы для перемещения пробойников вдоль осей X и Y.

Чтобы сбросить настройки станка, нажмите кнопку zero a BS для переключения между дюймами и миллиметрами, нажав кнопку inch millimeter. При использовании пробойника диаметром 1 мм для шаблона 9x8 расстояние между отверстиями, измеренное по центрам, должно составлять 2 мм, чтобы предотвратить слишком глубокое вдавливание приемного пробойника и его повреждение. Установите максимальную глубину вдавливания пробойника, поместив пустой кассетный блок в держатель и используя ограничительный винт глубины в верхнем левом углу направляющей Z; установите нижнее положение приемного пробойника на 1 мм выше дна кассеты. После выбора и разметки соответствующей области на срезе ткани и разработки шаблона для создания тканевого микромассива поместите приемной блок в держатель и затяните винты с помощью самой маленькой отвертки.

Избегайте чрезмерного затягивания винтов, чтобы парафин не отделился от кассеты. Нажмите на пробойник реципиента вниз примерно на пять миллиметров в блок реципиента и, используя ручку пробойника, поворачивайте его вперед и назад. Затем медленно снимите давление при нажатии вниз, чтобы пружины могли поднять пробойник вверх.

Используйте стилус, чтобы очистить пробойник и удалить парафиновый керн. Затем переместите турель, чтобы переключиться на пробойник для донорского образца. Далее установите мостик донорского блока так, чтобы донорский блок находился над держателем реципиентного блока.

Используйте соответствующий предметный слайд с окрашиванием гематилином и эозином, на котором отмечена область интереса, чтобы определить ткань, подлежащую забору. Удерживайте донорский блок в нужном положении левой рукой и нажимайте на панч правой рукой. Не давите на стилет. Ограничитель глубины не блокирует движение панча в правильном положении для донорского блока, поэтому важно прекратить нажатие, когда на стилете станет видна вторая метка.

Медленно поверните ручку пробойника один раз. Снимите давление вниз, продолжая удерживать донорский блок на мостике для донорского блока. Извлеките мостик и донорский блок.

Убедитесь, что донорский пробойник совмещен с отверстием, проделанным ранее. Отрегулируйте положение пробойника с помощью стопорных винтов. Если донорский пробойник и отверстие в реципиентном блоке не совмещены, осторожно надавите на пробойник вниз до тех пор, пока его кончик не достигнет верхней части отверстия в реципиентном блоке.

Удерживая инструмент в этом положении, с помощью стилета переместите столбик ткани в отверстие. Поверхность столбика должна быть выровнена по поверхности блока. Переместите турель обратно к реципиентному пробойнику.

Переместитесь в следующую позицию с помощью ручек регулировки по осям XY и повторите процесс выбивания образца из реципиентного блока до полного формирования массива. Чтобы извлечь реципиентный блок, ослабьте винты в держателе. Положите блок лицевой стороной вниз на предметное стекло, размещенное на подходящем штативе, и просушите блок при температуре 42 °C в течение 40 минут.

Извлеките предметное стекло и блок из печи и разгладьте поверхность блока, осторожно проведя по нему предметным стеклом. Поместите блок с предметным стеклом на охлаждающую пластину на 10 минут. Снимите предметное стекло с блока.

Блок готов к нарезке. После нарезки следует провести окрашивание и цифровизацию тканевого микромассива с использованием антител к интересующему белку. Для поиска данного белка в атласе белков человека перейдите на сайт www.proteinatlas.org.

Введите идентификатор ансамбля (ensemble id), номер доступа UniProt или название HGNC интересующего вас белка, например, insulin. Нажмите на выбранный белок и прокрутите страницу вниз до раздела сводки по нормальным тканям и органам (normal tissue and organ summary). В обзоре отображается экспрессия белка в поджелудочной железе.

Нажмите на вкладку. More tissue data. Появится представление нормальных тканей, отсортированных по органам.

Нажмите на поджелудочную железу, чтобы просмотреть результаты ИГХ для трех антител, направленных против одного и того же белка. Нажмите на изображение, чтобы просмотреть изображение поджелудочной железы в высоком разрешении. На этом рисунке представлены примеры качества тканевых микромассивов: ровный и правильно выровненный массив с достаточным расстоянием между рядами, столбцами и краем парафина. Здесь некоторые керны расположены слишком близко к краю, что, вероятно, приведет к проблемам при изготовлении срезов.

Этот тканевый микроматрица подвергся слишком длительному воздействию тепла и деформировался из-за отсутствия подходящего шаблона. Здесь представлен правильно срезанный препарат с прямыми и выровненными колонками, окрашенный гематоксилином и эозином. Использование затупленного или загрязненного лезвия может привести к расслоению, как показано здесь, или к сжатию срезов, как в данном случае.

Клетки герминативных центров в лимфатических узлах демонстрируют оптимально титрованные антитела, что приводит к специфическому цитоплазматическому окрашиванию без фона, как показано здесь. Отрицательное или слабое окрашивание наблюдается при слишком низкой концентрации первичных антител или при отсутствии целевого белка в иммуноокрашенных тканях. Данный срез ткани избыточно окрашен из-за слишком высокой концентрации первичных антител.

Темный цвет затрудняет определение субклеточной локализации из-за перекрытия сигналов, перекрестной реактивности и ложноположительных результатов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создать массив тканевых маркеров и как использовать его при анализе экспрессии белков с помощью иммуногистохимии. Вы также должны понять, как пользоваться атласом белков человека (Human Protein Atlas) для изучения экспрессии белков в тканях и клетках человека.