Методы изучения морфогенеза нейронов: Ex естественных условиях RNAi Электропорация в эмбриональной коры головного мозга мышей

Общая цель данного эксперимента — провести экспресс-оценку функции генов в развитии коры головного мозга с использованием органотипических срезов. Это достигается за счет введения плазмид, коэкс, экспрессирующей и ингибирующей РНК и маркера A GFP в кору головного мозга мыши. Короткие электрические всплески воздействуют на мозг, позволяя плазмидной ДНК трансфицировать нейронные клетки-предшественники.

Затем мозг препарируют, встраивают и разрезают для получения органотипических срезов, которые могут подвергаться морфогенезу нейронов ex vivo. Органотипические срезы могут быть найдены на предмет субпопуляций корковых нейронов с миграционными или морфологическими дефектами путем непосредственного наблюдения за клетками, меченными GFP. Здравствуйте, добро пожаловать в мою лабораторию в Университете Брауна на факультете молекулярной биологии, доктор Лиза и два студента, Кэт Зер и Марк Себа, продемонстрируют технику электропорации ex vivo и органотипическую культуру срезов, что является очень полезным методом для исследований нейроразвития.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в различных аспектах развития нервной системы, включая нейрогенез, миграцию нейронов и морфогенез нейронов. Поскольку этот анализ проводится в условиях, близких к условиям IBU, он представляет собой недорогую и быструю альтернативу созданию трансгенных или нокаутных животных для генов с неизвестной функцией. Наконец, по сравнению с технологией электрохирургии in vivo, успех этих экспериментов с электрооперациями vivo не зависит от профессиональной хирургии, развития навыков и может быть выполнен с более коротким временем обучения и навыками.

После усыпления беременной самки мыши препарируйте эмбрионы до ледяного холода, завершите HBSS, сохраняя их в индивидуальных плацентарных мешках. Далее в холодном растворе HBSS выпустите эмбрион из мешка и отрежьте его голову после первого позвонка для укола, поместите голову на лист параформной бумаги поверх чашки Петри с помощью изготовленного на заказ шприца Гамильтона. Введите от шести до восьми микролитров быстрой зеленой смеси ДНК через третий желудочек.

Оттуда смесь заполнит оба боковых желудочка в корковых пузырьках. Для электропорации используются платиновые электроды пинцета BTX. Поместите положительный электрод ближе к той стороне коры головного мозга, на которую будет производиться электропорация.

Например, электрод должен находиться на верхней части головы для дорсальной коры. Для высокой эффективности трансфекции всегда регулируйте концентрацию ДНК с точностью до одного микрограмма на микролитр и используйте ДНК, выделенную из препарата Maxi. При необходимости используйте набор без эндотоксинов для очистки ДНК после электропорации.

Высиживайте голову на льду не менее пяти минут, прежде чем препарировать ее. Очень важно использовать правильное количество электрических импульсов и тока при проведении электропорации, чтобы не повредить мозг молодого эмбриона. После электропорации ткань становится очень хрупкой.

Важно проводить вскрытие очень осторожно, так как кожа и школа могут натягивать мозговые оболочки корковых пузырьков, и это может повредить корковые пузырьки при удалении из черепа. Через пять минут препарируйте мозг на холоде. HBSS начните с того, что сделайте небольшой разрез на боковой стороне головы и снимите кожу с боковых сторон головы.

Затем с помощью тонких щипцов аккуратно отделите пиа от мозга. Удалите неповрежденный мозг из черепа. Когда закончите, держите мозг в ледяном HBSS и приготовьтесь к встраиванию ткани.

Начните заполнение форм с низкой температурой плавления на 3%. Агрос. Поместите формы на лед, чтобы агрос застыл у дна формы. Во-первых, необходимо обеспечить, чтобы мозг оставался поддерживаемым и центрированным.

Теперь с помощью тонких щипцов аккуратно извлеките мозг из HBSS, поглотите излишки буфера салфеткой или фильтровальной бумагой и установите мозг на низкую температуру плавления. Агрос. Затем используйте наконечник пипетки, чтобы закрутить мозг внутри формы, чтобы максимизировать контакт между агросом и тканями. После переноса всех мозгов расположите каждый мозг примерно в одинаковой ориентации и глубине в его форме.

Арос застынет примерно за пять минут. Так что работайте быстро. Дайте аросу полностью застыть, высиживая еще пять минут на льду.

Обрежьте лишние элементы перед установкой блоков. Затем прикрепите блоки агроса друг к другу с помощью быстро склеивающегося пластикового клея, каждый мозг в стопке должен быть расположен своими обонятельными луковицами вверх. После того, как блоки прикреплены, обрежьте их, чтобы убедиться, что каждый мозг будет разрезан вибрато.

Затем сразу же погрузите их в ледяной HBSS. Чтобы нарезать блоки, установите скорость вибрато на низкую скорость, примерно в половину максимальной, и установите частоту вибрации лопасти на самую высокую настройку. Затем сгенерируйте корональные срезы толщиной 250 микрон, извлеките срезы с помощью изогнутого тонкого шпателя и перенесите их в тканевые лунки с помощью тонкой кисти или щипцов.

Если ткань выпадает из агроса, то тканевой контакт агроса недостаточно сформирован в тканевом культурном колпаке, подготовьте шестилуночный планшет с 1,8 миллилитровыми срезами питательной среды на лунку и поместите в каждую органотипическую вставку с кодом ламинина политического лизина. Хорошо добавьте 500 микролитров среды для срезов в верхнюю часть органотипических вкладышей для слайсов. Затем переложите до пяти ломтиков на каждую вставку.

Затем удалите излишки среды с верхней части срезов, чтобы убедиться, что срезы максимально сохраняют свою морфологию и имеют минимальную гибель клеток. Важно, чтобы граница раздела жидкого воздуха оставалась здоровой и срезы не плавали в среде. Наконец, инкубируйте ломтики при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе.

Заменяйте половину объема среды под мембраной через день. Срезы не должны плавать на медианейронах, экспрессирующих электропорированные конструкции, можно визуализировать уже через восемь часов после электропорации после желаемых дней культивирования. Закрепите срезы в мембране для анализа.

Промойте каждый органический типичный вкладыш теплым PBS в течение пяти минут. Всего выполните три полоскания PBS, а затем зафиксируйте ткань 4%-ным параформным альдегидом на один час при четырех градусах Цельсия. После фиксации ткани можно проанализировать клеточными маркерами или просто запачкать крючками морилкой Через час промыть срезы тремя 10-минутными промывками в одном XPBS.

Затем процеживаем ломтики в течение двух часов при комнатной температуре в 10%-ном растворе сыворотки крови в одном XPBS с легким встряхиванием. Затем испачкайте ткани крючками в течение одного часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. Удалите пятно тремя 10-минутными стирками в одном XPBS с легким встряхиванием во время ожидания.

Поместите предметные стекла из матового стекла в водяную камеру, достаточно глубокую, чтобы можно было искупать салфетки после того, как они будут помещены на предметные стекла. Чтобы смонтировать ломтики. Сначала разрежьте пленку скальпелем.

Во-вторых, с помощью тонких щипцов перенесите до пяти связанных с мембраной ломтиков на каждое предметное стекло, погруженное в воду. В-третьих, удалите лишнюю воду с каждой горки. В-четвертых, нанесите каплю раствора для напольного крепления на каждый срез мозга.

И, наконец, аккуратно положите крышку сверху на ломтики и удалите пузырьки воздуха. Затем срезы готовы к микроскопии, в зависимости от количества электропорированной ДНК и эмбриональной стадии. Было обнаружено, что при электропорации эффективность трансфекции варьируется.

Через восемь часов после трансфекции с помощью Р-глушителя векторные клетки GFP начали экспрессировать GFP. В течение более длительного периода культивирования клетки претерпевают нормальную последовательность нейрогенных событий, включая пролиферацию, миграцию и раннюю дифференцировку нейронов. Эти срезы сохраняли свою морфологию в течение пяти дней, при условии, что воздушный интерфейс среды хорошо поддерживался во время попытки этой процедуры.

Важно провести весь эксперимент с момента усыпления животного до момента помещения срезов в мембранные вставки в течение двух часов, чтобы свести к минимуму гибель клеток после этой процедуры. Другие, такие как добавление экзогенных факторов к органотипическому лизису, могут быть выполнены, чтобы ответить на такие вопросы, как: какова роль различных факторов роста или фармакологических агентов в различных механизмах развития нервной системы?