Одновременная запись кальция Сигналы от выявленных нейронов и пищевое поведение DROSOPHILA MELANOGASTER

Общая цель данной процедуры заключается в мониторинге нейронной активности с помощью кальциевого имиджинга одновременно с наблюдением за пищевым поведением. Это достигается путем первоначального помещения мухи в аппарат для мух. Затем производится диссекция головы мухи для обнажения мозга.

Затем аппарат с препарированной мухой помещают на предметный столик микроскопа. Заключительным этапом процедуры является стимуляция хоботка с помощью сахарного фитиля. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие активацию идентифицированного нейрона с помощью кальциевого имиджинга, сопоставленные с выдвижением хоботка, зафиксированным при видеосъемке поведения.

Впервые идея этого метода возникла у меня, когда я задумался о глазах плавающих бобров, которые находятся на поверхности воды. У бобров разделенные глаза, что позволяет им видеть одновременно и над, и под поверхностью воды. Сложность моего эксперимента заключается в том, что мозг и SCU расположены близко друг к другу, но если разделить их аккуратно, подобно глазам бобров, то можно сохранить SCU сухими, в то время как мозг будет открыт в сателлите.

Я создал очень простую перегородку непосредственно над SCU, чтобы отделить сухую поверхность от области ширины. Сформируйте платформу из крышки 35-миллиметровой чашки Falcon, расплавив боковую стенку и обточив ее для создания подходящего угла и толщины. Просверлите в платформе отверстие для головы мухи так, чтобы ротовые органы были свободно открыты наружу из камеры. Отрежьте конец наконечника пипетки, сделав его достаточно широким, чтобы в него поместилось тело мухи, а затем приклейте наконечник к платформе.

После того как взрослая муха подвергалась голоданию в течение 24 часов при температуре 25 °C, анестезируйте ее, поместив с помощью пинцета в пластиковую пробирку объемом 15 мл, стоящую на льду. Поместите муху в камеру для мух и осторожно протолкните ее внутрь до тех пор, пока она не утратит способность к движению.

Герметизируйте области вокруг проксимального отдела хоботка или рострума у внутреннего края отверстия, нанеся небольшое количество светоотверждаемого клея на боковые поверхности и сверху рострума, аккуратно распределяя клей с помощью инструмента для наращивания ресниц или аналогичного приспособления. Также нанесите клей изнутри тела мухи в пространство между дорсальной частью головы и внутренним краем отверстия. В завершение отвердите клей, используя минимальную интенсивность синего света, достаточную для полимеризации, чтобы избежать повреждения мухи.

Чтобы стабилизировать голову мухи и открыть вентральную часть SOG, прикрепите нить, чтобы удерживать рострум в частично приподнятом положении. Зафиксировав муху, заполните поверхность платформы физиологическим раствором без сахарозы. С помощью вольфрамового лезвия и пинцета с заостренными кончиками (далее именуемого «заостренный пинцет») вскройте головную капсулу, чтобы обнажить SOG.

Scis zips. Это демонстрация техники scis zips: для сравнения отрезается волокно от салфетки Kim wipe. Сначала процедура выполняется ирисными ножницами в поле зрения, а затем перед миллиметровой измерительной линейкой.

Сначала с помощью вольфрамового лезвия сделайте надрез по заднему краю. Затем разрежьте боковой и передний края, используя заостренный пинцет. Поднимите отрезанный фрагмент кутикулы пинцетом и удалите его.

Отрежьте антенны и антенные нервы с помощью пинцета. Затем селективно удалите воздушные мешки между SOG и кутикулой, чтобы стабилизировать мозг и предотвратить возникновение артефактов движения. Далее перережьте пищевод со стороны глотки и со стороны входа в SOG, чтобы разорвать связь между глоткой и мозгом.

Затем, после идентификации и извлечения мышцы 16, отделите любые трахеи, соединяющие мозг и кутикулу. Поместите мух на предметный столик конфокального микроскопа с вращающимся диском и переключитесь на объектив с водным погружением для получения изображений. Затем сделайте один оптический срез с частотой 4 Гц и временем экспозиции 122 мс, используя возбуждающий лазер с длиной волны 491 нм, сфокусированный на интересующей области.

Используйте иглу шприца с небольшим фитильком из японской бумаги, выступающим из кончика, чтобы предложить мухе сахарозу. Выпустите маленькую каплю раствора сахарозы на фитилек, затем втяните ее с помощью инъектора, подключенного к игле через гибкую трубку, используя джойстиковый манипулятор для удержания иглы.

Прикоснитесь пропитанным фильтровальным фитилем к кончику пробóса, но лишь на мгновение, чтобы избежать насыщения. Одновременно с кальциевым имиджингом отслеживайте ответную реакцию вытягивания пробóса или поведение PER с помощью CCD-камеры, установленной на диссекционном микроскопе; убедитесь, что сбор данных осуществлен в течение одного часа после диссекции.

Здесь показан типичный ответ расширения prob Bois на стимуляцию WIC, содержащим 100 millimolar сахарозы. Водный раствор визуализировали с помощью лазера с длиной волны 491 nanometer для регистрации флуоресценции G CAMP. Одновременная визуализация кальция во время поведения при расширении prosa, показанная сначала до, а затем после стимуляции, позволяет визуализировать индуцированные сахарозой ответы GAMP 3.0 в мотонейроне мышцы-протрактора рострума.

При количественном анализе стационарного состояния ответ GAMP 3.0, индуцированный сахарозой, показывает, что мотонейроны реагируют на стимуляцию сахарозой резким увеличением флуоресценции с последующей фазой восстановления до базового уровня, которая длится несколько секунд. Данная платформа для мух позволяет использовать другие методы, такие как электрофизиология, оптогенетика, психогенетика или химическая активация нейронов, а также TimeLapse-визуализацию структур, меченных GFP, для поиска ответов на дополнительные вопросы, например, о корреляции между синаптической пластичностью и памятью.