Одновременная запись кальция Сигналы от выявленных нейронов и пищевое поведение DROSOPHILA MELANOGASTER

Общая цель этой процедуры заключается в мониторинге активности нейронов с помощью визуализации кальция одновременно с наблюдением за пищевым поведением. Это достигается путем предварительного введения мухи в аппарат для мух. Затем голова мухи препарируется, чтобы обнажить мозг.

Затем аппарат мухи с расчлененной мухой размещается на предметном столике микроскопа. Заключительным этапом процедуры является стимуляция pro Bois с помощью сахарного фитиля. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают активацию идентифицированного нейрона с помощью визуализации кальция, коррелированную с расширением Probus посредством видеозаписи поведения.

Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я подумал о глазах бьющегося пива, которые плавают на поверхности воды. У нас, любителей пива, раздвоены глаза, и мы можем видеть как над, так и под поверхностью воды. Сложность моего эксперимента заключается в том, что мозг и SCU находятся близко друг к другу, но если они расположены друг от друга, как глаза нашего пива, мы можем сохранять SCU сухими, пока мозг находится на спутнике.

Для этого я сделал очень простую перегородку прямо над SCU, чтобы отделить сухую поверхность от места ширины, сформировать платформу из крышки 35-миллиметрового блюда для сокола, расплавив боковую стенку и вырезав ее, чтобы сформировать соответствующий угол и толщину. Просверлите отверстие в платформе, чтобы принять головку мухи, таким образом, чтобы ротовые части были свободно открыты наружу камеры. Отрежьте конец кончика пипетки ровно настолько, чтобы он мог принять тело мухи, а затем приклейте кончик к платформе.

После голодания взрослого человека летят в течение 24 часов при температуре 25 градусов по Цельсию. Обезболите муху, поместив ее в пластиковую трубку объемом 15 миллилитров, стоя на льду с помощью щипцов. Вставьте муху в камеру мухи и осторожно втолкните ее внутрь до тех пор, пока она не сможет двигаться.

Запечатайте окружающие части проксимального пробоса или рострума к внутреннему краю отверстия, нанеся небольшое количество светоотверждающего клея по бокам и над рострумом, с помощью ресницы или аналогичного инструмента тщательно распределите клей. Также нанесите клей с внутренней стороны мушек на пространство между спинной частью головы и внутренним краем отверстия. Наконец, отверждайте клей при самом слабом освещении синим светом, достаточном для отверждения, чтобы не повредить муху.

Чтобы стабилизировать голову мухи и обнажить брюшную часть СОГ, прикрепите нитку, чтобы удерживать рострум частично приподнятым. Установив мушку на место, заполните поверхность платформы безсахарозным раствором. Откройте капсулу головки, чтобы обнажить СОГ, с помощью вольфрамового лезвия и щипцов с заточенными наконечниками, которые мы называем заточенными щипцами.

Застежка-молния. Это демонстрация застежек-молний scis, вырезание волокна из салфетки Kim для сравнения. Сначала это выполняется ножницами по радужной оболочке глаза в поле зрения, а затем перед линейкой с градуировкой в один миллиметр.

Сначала с помощью вольфрамового лезвия сделайте надрез через задний край. Затем прорежьте боковой и передний края с помощью заточенных щипцов. Поднимите отрезанный кусочек кутикулы с помощью щипцов и удалите его.

Перережьте усики и нервы антенн с помощью щипцов. Затем выборочно удалите воздушные мешки между СОГ и кутикулой, чтобы стабилизировать работу мозга и предотвратить артефакты движения. Далее разрежьте пищевод на конце по направлению к глотке и на конце, входящем в СОГ, чтобы удалить связь между глоткой и мозгом.

Затем, определив и вытащив мышцу 16, отсоедините любую трахею, соединяющую мозг и кутикулу. Поместите мух на предметный столик вращающегося дискового конфокального микроскопа, а для визуализации переключитесь на водную погружную линзу. Затем сделайте один оптический срез с частотой в четыре герца и временем экспозиции 122 миллисекунды с помощью лазера с возбуждением 491 нанометровое возбуждение, сфокусировавшись в интересующей области.

Используйте иглу шприца с маленьким фитилем японского. Не торчала ли она из кончика бумаги, чтобы предложить мухе сахарозу? Вылейте небольшую каплю раствора сахарозы на фитиль, затем аспирируйте его с помощью инжектора, соединенного с иглой через гибкую трубку, с помощью джойстикового манипулятора для удержания иглы.

Приложите промокший бумажный фитиль к кончику щупов, но только на мгновение. Чтобы избежать насыщения. Отслеживайте реакцию расширения PROBUS или поведение PER с помощью ПЗС-камеры, прикрепленной к микроскопу для вскрытия, одновременно с визуализацией кальция и обязательно соберите данные в течение одного часа после вскрытия.

Здесь показана типичная реакция Prob Bois extension на стимуляцию WIC, содержащей 100 миллимоляров сахарозы. Водный раствор визуализируется с помощью лазера с яркостью 491 нанометр для флуоресценции G CAMP. Одновременная визуализация кальция во время реакции на разгибание прозы, показанная здесь сначала до, а затем после стимуляции, позволяет визуализировать индуцированные сахарозой реакции GAMP 3.0 в моторном нейроне для транспортира рострумной мышцы.

В звезде количественного определения индуцированного сахарозой ответа GAMP 3.0 показано, что моторные нейроны реагируют на стимул сахарозой резким увеличением флуоресценции с последующей фазой восстановления в течение нескольких секунд до исходного уровня. Платформа позволяет использовать другие методы, такие как электрофизиология, оптогенетика или психогенетика, или химическая активация нейронов, или лабораторная визуализация помеченных GFP структур с помощью TimeLapse, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как корреляция между синаптической пластичностью и памятью.