В пробирке Ассамблеи Semi-искусственные молекулярные машины и его использование для обнаружения повреждений ДНК

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать способ сборки и применения сенсора повреждения ДНК с двойной меткой, который маркирует два основных типа разрывов ДНК в срезах тканей. Сенсор состоит из 30-нуклеотидного олигонуклеотида ДНК с двойной меткой ZI и Rumine, а также фермента вакцинной топоизомеразы I (vac topo), который подвергается самосборке. Когда vac topo связывается с 30-нуклеотидным фрагментом, запускается механизм действия, при котором topo расщепляет олигонуклеотид на 3'-конце последовательности узнавания, в результате чего образуются активированный комплекс vac topo с меткой fitzy и свободная шпилька с аминной меткой.

Благодаря терминальной 3'-гидроксильной группе эти единицы являются короткоживущими и быстро собираются обратно в исходную конструкцию, которая затем расщепляется. В отсутствие дополнительных внемолекулярных разрывов ДНК эти две единицы непрерывно разделяются и снова соединяются циклически. При применении молекулярного сенсора к срезам тканей с повреждениями ДНК детектирующий блок, меченный Fitz, селективно прикрепляется к тупым концам разрывов ДНК с 5'-гидроксильной группой.

Детекторный блок с меткой R-домином лигирует тупоконечный разрыв с пяти-праймовым фосфатом. При наличии Т4 ДНК-лигазы с помощью флуоресцентной микроскопии можно получить результаты, демонстрирующие наличие и распределение разрывов ДНК 1-го и 2-го типов в клетках. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами детекции DSB, такими как TUNEL, является его более высокая специфичность, а также предоставление дополнительной информации за счет маркировки как аутономных, так и фагоцитарных фаз апоптоза.

С точки зрения нанотехнологий, данный сенсор представляет собой биоинспирированный подход, при котором реальные биологические структуры и архитектуры адаптируются для создания нетоксичных устройств молекулярного масштаба. Как правило, исследователи, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как успех процедуры зависит от использования высокоактивного препарата Toro SOM и правильной обработки срезов для предотвращения чрезмерного переваривания протеиназой K. Срезы тканей для данной процедуры должны быть подготовлены до сборки молекулярного устройства. Толщина срезов, полученных из паральдегида, должна составлять от пяти до шести микрон.

Рекомендуется использовать блоки тканей, фиксированные в парафине. Поместите предметное стекло с срезом ткани в штатив для стекол и удалите парафин в ксилоле в течение 15 минут. Через 15 минут перенесите стекло в свежую ванночку с ксилолом еще на пять минут.

Регидратируйте срез, последовательно обрабатывая слайд растворами этанола следующих концентраций: 96% этанола дважды по пять минут, затем 80% этанола в течение пяти минут и, наконец, водой.

Дважды по пять минут. После регидратации обработайте срез протеиназой K. Используя 100 µL раствора с концентрацией 50 µg/mL на срез, инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре в увлажненной камере. В зависимости от типа ткани время переваривания может потребовать корректировки, однако следует избегать избыточного переваривания, так как это приводит к исчезновению сигнала и разрушению среза по завершении процесса.

Дважды промойте предметное стекло в дистиллированной воде по 10 минут. Нанесите 2% BSA для предварительной блокировки и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре в увлажненной камере. В это время соберите молекулярную машину, как показано далее в этом видео.

Все реагенты для сборки молекулярной машины рассчитаны на общий объем 25 microliters, чего достаточно для одного цикла детектирования в срезе ткани среднего размера. При необходимости объем можно увеличить, смешав компоненты в небольшой пластиковой пробирке. Добавьте следующие реагенты в указанном порядке, используя дистиллированную воду.

15% полиэтиленгликоль 8,000 T четыре ДНК-лигазный буфер, дважды меченные олигонуклеотиды, вакцинная топоизомераза один и T четыре ДНК-лигаза осторожно перемешиваются пипетированием. Молекулярный конструкт практически мгновенно самособерется в этом растворе и может быть использован сразу при комнатной температуре. Чтобы начать процедуру маркировки разрывов ДНК, удалите раствор для предварительной блокировки со стекла.

Нанесите по 25 µL готовой реакционной смеси на каждую секцию. Накройте секцию пластиковым покровным стеклом и поместите предметное стекло в увлажненную камеру. Защитите от света, обернув камеру алюминиевой фольгой, и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре.

Хотя сигналы лигазы и топоизомеразы можно наблюдать уже после одного часа инкубации, во многих случаях сигнал лигазы можно усилить. Для усиления сигнала повторно нанесите реакционную смесь без vac topo и олигонуклеотида один, но с олигонуклеотидом три и T four DNA Ligase, накройте срез пластиковым покровным стеклом и инкубируйте во влажной камере в течение 18 часов. На следующий день при комнатной температуре аккуратно погрузите предметное стекло вертикально в стакан Копла с водой комнатной температуры, чтобы снять покровное стекло.

Затем трижды промойте срез в дистиллированной воде по 10 минут каждый раз. Ополосните срез бикарбонатно-натриевым буфером. Промывка этим щелочным раствором усиливает флуоресценцию Fitzy, которая чувствительна к pH и значительно снижается при pH ниже семи.

Наконец, накройте срез антифейдинговым раствором, содержащим DPI для контрастирования и окрашивания ядер, и наложите покровное стекло. Теперь срезы готовы к флуоресцентной микроскопии. На данном рисунке представлен срез ткани тимуса, обработанного дексаметазоном, где с помощью молекулярной машины были обнаружены тупоконечные разрывы ДНК типов DNA1 и DNA2 в областях коркового слоя тимуса, подвергающихся апоптозу; зеленая цитоплазматическая флуоресценция указывает на разрывы типа DNA2, а красная — на корковые макрофаги, поглощающие ядерный материал апоптотических тимоцитов.

Этот сигнал вырабатывается вакуолярной топоизомеразой и локализуется в лизосомах FGA с ДНК, содержащей 5'-гидроксильную группу. Двуцепочечные разрывы отмечены красной флуоресценцией, указывающей на метки одного типа разрывов ДНК, в ядрах апоптотических тимоцитов, не поглощенных макрофагами. Массовое количество тимоцитов одновременно подвергается апоптозу.

Сопровождается образованием пяти парных одноцепочечных разрывов фосфатного остова, визуализированных с помощью мечения лигазой. Эти разрывы расположены на периферии ядра и образуют кольцеобразные структуры. Все клеточные ядра окрашены в синий цвет с помощью контрастного окрашивания dpi.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что срезы не должны высыхать между добавлением различных растворов. Также следует хранить все ферментные препараты на льду до добавления срезов, а флуоресцентные зонды защищать от света во время реакции маркирования и после ее завершения. Данный метод позволил визуализировать все фазы распада гетероцитоплазматических клеток.

Данный сенсор сам по себе является примером применения подхода «зеленой» нанотехнологии при проектировании наноразмерных частиц, зондов и машин. Этот подход сочетает искусственные компоненты с природными деталями молекулярных машин. Целью является устранение токсичности и нежелательной биологической реактивности этих высокодисперсных наноматериалов.