Простая и надежная В естественных условиях И В пробирке Подход к изучению вируса Ассамблеи

Общая цель данной процедуры заключается в изучении сборки вируса in vivo и in vitro. Это достигается путем экспрессии РНК вируса мозаики брокколи в бактериях с последующим введением их в клетки растений с помощью агроинфильтрации. Затем вирионы BMV очищают из инфильтрированных листьев.

Затем подготавливают субъединицы капсидного белка для сборки in vitro. В завершение проводят сборку BMV Varians in vitro с использованием капсидного белка и красителя индоцианина зеленого. В конечном итоге результаты демонстрируют сборку bro mosaic varians in vitro путем формирования «оптических призраков», которые можно определить по абсорбции и эмиссии флуоресценции.

Сегодня мы продемонстрируем метод, называемый фильтрацией; эта техника полезна для доставки вирусных компонентов в растения. Основным преимуществом данного метода является отсутствие необходимости в создании транскриптов in vitro, и в то же время он позволяет доставить несколько компонентов в одну и ту же клетку, что обеспечивает синхронизацию инфекции. В настоящее время мы работаем над использованием вируса мозаики брокколи в сочетании с одобренным FDA хромофором Cyanine Green для создания нового типа наночастиц для биомедицинских целей.

В частности, мы намерены использовать эти конструкции, которые мы называем оптическими проводящими призраками или OB g, для методов оптической визуализации, включая флуоресцентную и фотоакустическую томографию, а также в качестве носителя для лазерной терапии. Конкретное клиническое применение, которое мы сейчас разрабатываем, заключается в использовании этих конструкций для визуализации рака яичников в сочетании с интраоперационными процедурами. Идея состоит в том, что мы можем функционализировать эти конструкции.

ОБГ со специфическим нацеливающим мотивом, способным распознавать остаточные опухолевые клетки, которые при раке яичников могут находиться преимущественно в брюшной полости. С чашки с предварительно подготовленной агробактерией, содержащей РНК-1, 2 или 3 вируса коричневой мозаики, выберите одну колонию для инокуляции в 2 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл рифампицина. Инкубируйте культуру в течение одного дня при 28 °C в орбитальном шейкере при 250 об/мин. На следующий день инокулируйте 50 мл среды LB в колбе Эрленмейера объемом 500 мл одним миллилитром культуры и инкубируйте в течение 16 часов при 28 °C в орбитальном шейкере при 250 об/мин. Когда культуры достигнут OD 600 равной 1,0, перенесите их в стерильные пробирки объемом 30 мл и центрифугируйте в течение 10 минут.

При 5 000 об/мин и температуре четыре градуса Цельсия растворите осадок в 10 миллилитрах 10 миллимолярного хлорида магния и центрифугируйте в течение 10 минут при 5 000 об/мин и четырех градусах Цельсия. Повторите этот шаг еще один раз, чтобы обеспечить полное удаление антибиотика. Затем суспендируйте осадок в 10 миллилитрах буфера, содержащего 10 миллимолярный MES и 10 миллимолярный хлорид магния.

Измерьте OD 600 для каждой культуры и доведите значение OD 600 до 0.1, используя 10 millimolar хлорида магния и 10 millimolar MES. Затем объедините по 10 milliliters каждой из трех суспензий культур с OD 600 равной 0.1. Добавьте ацетофенон до конечной концентрации 100 millimolar.

Осторожно перемешайте и оставьте смесь в покое при комнатной температуре на три часа. После инкубации наберите культуру в одномиллилитровый шприц без иглы. Введите суспензию культуры в абаксиальную сторону двух-трех хорошо развитых листьев N hamana, осторожно прижимая шприц к одной половине абаксиальной поверхности каждого листа.

Выдержите инфильтрированные растения в теплице при температуре 24 °C в течение трех-четырех дней перед сбором листьев. После очистки вирионов BMV приготовьте один литр 1x буфера для диссоциации вируса. Затем подготовьте диализную мембрану.

Согласно методу Sambrook et al., поместите от 5 до 10 mg/mL очищенного вируса в диализный мешок и поместите мешок в колбу с 1x буфером для диссоциации вируса. Проводите диализ вируса в течение 24 часов при температуре 4 °C при перемешивании.

Соберите раствор из диализного мешка и центрифугируйте при 30 000 об/мин в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы осадить любые несвязанные вирусные частицы. Центрифугируйте супернатант при 30 000 об/мин в течение трех часов при температуре четыре градуса Цельсия. После подготовки РНК-транскриптов для последующей сборки в вирионы, смешайте субъединицы капсидного белка и РНК-транскрипты в соотношении один к пяти.

Перенесите смесь в диализный мешок и надежно закрепите его, чтобы избежать утечек. После приготовления одного литра 1X буфера для сборки РНК проведите диализ смеси для реакции ресборки в этом буфере при температуре 4 °C в течение 24 часов; на следующий день извлеките смесь из диализного мешка и добавьте 1,5 мл буфера для сборки РНК, затем снова центрифугируйте при 30 000 об/мин в течение трех часов при 4 °C. После этого удалите супернатант и ресуспендируйте осадок.

Затем оцените концентрацию вирионов при OD 260 нанометрах. После этого определите концентрацию субъединиц капсидного белка при OD 280 нанометрах или с помощью других методов, таких как анализ Брэдфорда, чтобы оценить целостность диссоциированных субъединиц капсидного белка. Проведите электрофорез в 12–15% SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттингом. Наконец, следуйте процедуре, описанной в письменном протоколе, для создания оптических вирусных призраков или «ov cheese».

Здесь представлено изображение просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) отрицательно окрашенных варионов BMV, очищенных из растений end hamana, которые были подвергнуты агроинфильтрации смесью всех трех конструктов BMV дикого типа. На данном ПЭМ-изображении видны отрицательно окрашенные оптические вирусные «призраки», содержащие индоцианин зеленый. Далее показаны спектры поглощения и флуоресценции для полученных оптических вирусных «призраков».

Данная методика может быть выполнена за пять минут на один образец. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как инкапсулировать вирусные или невирусные компоненты в субъединицы капсидного белка.