Вскрытие и культуры мышь дофаминергической и стриатуме эксплантов в трехмерных Анализы коллагеновой матрице

Общая цель данной процедуры заключается в культивировании эксплантатов стриатума и дофаминергических нейронов для изучения развития мезолимбического и нигростриального путей. Это достигается путем первоначального микродиссекции стриатума и дофаминергических отделов среднего мозга из эмбрионов мыши на стадии E 14.5. На втором этапе из диссекированной ткани вырезают эксплантаты соответствующего размера.

Затем эксплантаты размещают в коллагеновом геле в непосредственной близости друг от друга. Заключительным этапом является культивирование эксплантатов в течение двух-трех дней для обеспечения роста аксонов. В конечном итоге используется иммуногистохимический анализ на специфические нейрональные маркеры, чтобы продемонстрировать и количественно оценить аттрактивные или репульсивные реакции аксонов.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, такими как культуры диссоциированных клеток или двух эксплантатов DX, является то, что коллагеновый матрикс обеспечивает трехмерный субстрат для экзонов, имитирующий внеклеточную среду. Кроме того, коллагеновый матрикс позволяет формировать относительно стабильные градиенты белков, высвобождаемых эксплантатами X или клетками, расположенными поблизости. Процедуру продемонстрируют Ава Смит и Франческа, еще два аспиранта из моей лаборатории.

Для начала данной процедуры извлеките эмбрионы мыши на стадии E 14.5 из матки матери. Храните их в среде L 15 на льду до начала использования. Затем перенесите эмбрион под микроскоп и изолируйте головной мозг из эмбриона.

Затем удалите цефалон, произведя разрез вдоль медиальной части каждой цефалической пузырьковой структуры. После этого удалите мозговую оболочку. Сделайте дорсовентральный разрез сразу ростральнее главного цефалического изгиба.

Затем сделайте еще один дорсовентральный разрез чуть впереди цефалического сгиба. После этого сделайте рострокаудальный разрез вдоль дорсальной срединной линии с помощью ножа для микродиссекции, чтобы обнажить лежащую под ним ткань вентральной части среднего мозга. Будьте осторожны, чтобы не повредить ткань вентрального среднего мозга, так как в ней расположены дофаминергические нейроны.

После этого сделайте два поперечных разреза вдоль вентральной срединной линии, чтобы удалить ткань дорсальной части среднего мозга. Затем, используя микродиссекционный нож, разделите оставшуюся ткань вентральной части среднего мозга на X эксплантатов и поместите их на хранение. Перенесите X эксплантатов в среду L 15 с добавлением 5% FBS на лед до начала использования.

Теперь перенесите полученные ранее при диссекции среднего мозга головные пузыри цыпленка под микроскоп. Удалите таламус, произведя разрез между таламусом и стриатумом с помощью пинцета. Затем сделайте медиолатеральный разрез ростральнее стриатума, чтобы удалить ростральные структуры, такие как обонятельная луковица.

Затем повторите этот шаг для ткани, расположенной рядом со стриатумом. После этого расположите оставшийся срез так, чтобы получить корональный вид стриатума. Стриатум можно узнать по чуть более прозрачной части ткани.

Затем изолируйте стриатум и нарежьте его на имплантаты с помощью ножа для микродиссекции. Избегайте использования более темной ткани рядом с срединной линией, которая содержит мигрирующие нейроны латерального и медиального ганглионарных выступов. Добавьте каплю подготовленного коллагена на покровное стекло в лунку четырехлуночной чашки.

Выдержите в инкубаторе при 37 °C и 5% углекислого газа в течение 30 минут. За время инкубации коллаген подвергнется желатинизации. После того как коллаген желатинизируется, перенесите с помощью пипетки с наконечником на 200 µL дофаминергические эксплантаты или эксплантаты из слюнных желез в коллаген.

Затем с помощью иглы переместите экспланты так, чтобы они находились в непосредственной близости друг от друга. Соблюдайте расстояние между ними, примерно равное диаметру одного экспланта. После этого удалите излишки среды.

Добавьте 20 µL подготовленного коллагена поверх эксплантата. Это часто приводит к смещению эксплантатов. С помощью иглы верните эксплантаты в исходное положение.

Оставьте коллаген затвердевать при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем перенесите его в инкубатор при 37 °C с содержанием 5% carbon dioxide на 30 минут. После застывания коллагена добавьте 400 µL среды для эксплантов и культивируйте в течение двух-трех дней в инкубаторе при 37 °C.

Для мягкой фиксации эксплантов добавьте 4% параформальдегид и выдержите их при комнатной температуре в течение одного часа. Через один час промойте их в PBS при комнатной температуре трижды, по 15 минут за каждую промывку.

Затем после удаления PBS инкубируйте их в блокирующем буфере в течение двух часов. После этого инкубируйте их в течение ночи с первичными антителами и блокирующим буфером при температуре четырех градусов Цельсия. На следующий день пять раз промойте их в PBS при комнатной температуре, по одному часу на каждую промывку. Затем инкубируйте их со вторичными антителами, конъюгированными с соответствующим флуорохромом.

Инкубируйте в блокирующем буфере в течение ночи при температуре 4 °C. Начиная с этого этапа, накройте эксплантаты алюминиевой фольгой, чтобы минимизировать их воздействие света. Промывайте их в PBS в течение ночи при температуре 4 °C, после чего на следующий день проведите несколько промывок.

Затем закрепите эксплантаты на предметном стекле микроскопа, используя среду для заключения с пролонгатором антифейдинга, расположив эксплантаты стороной образца вниз. Очень осторожно накройте среду покровным стеклом, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха под него. После этого получите цифровые изображения x эксплантатов с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.

Используя эти изображения, разделите каждый эксплантат X на квадранты, чтобы выделить проксимальный и дистальный квадранты. После этого измерьте длину 20 самых длинных нейритов, выходящих из эксплантата X, как в проксимальном, так и в дистальном квадрантах. Используйте среднюю длину 20 самых длинных нейритов для расчета соотношения проксимального и дистального сегментов для каждого отдельного эксплантата.

Отношение проксимальной и дистальной частей больше единицы указывает на аттракцию аксонов, в то время как отношение меньше единицы свидетельствует о репульсии аксонов. Здесь представлен срез среднего мозга, окрашенный антителами к тирозингидроксилазе, демонстрирующий рост аксонов.

Пунктирная линия обозначает соседние эксплантаты. Стрелки здесь указывают на отдельные нейриты и конусы роста. Ниже приведен пример количественного определения проксимально-дистального соотношения.

Они разделены на равные квадранты. Проксимальный квадрант обращен к соседним эксплантам X, в то время как дистальный квадрант обращен в противоположную сторону. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить совместное культивирование дофаминергических и страто-эксплантов для исследования развития мезоаксонального и нигростриального путей, а также для изучения молекулярных механизмов, участвующих в формировании этих путей.