Вскрытие и культуры мышь дофаминергической и стриатуме эксплантов в трехмерных Анализы коллагеновой матрице

Общая цель данной процедуры заключается в культивировании дофаминергических и стриальных эксплантатов для изучения развития мезолимбического и нигростриарного путей. Это достигается путем предварительной микродиссекции стриатума и дофаминергических ядер среднего мозга эмбрионов мыши на стадии E 14.5. Вторым этапом является вырезание эксплантатов подходящего размера из диссекированной ткани.

Затем эксплантаты помещают в коллагеновый гель в непосредственной близости друг от друга. Заключительным этапом является культивирование эксплантатов в течение двух-трех дней для обеспечения роста аксонов. В итоге используется иммуногистохимический анализ на специфические нейрональные маркеры для визуализации и количественной оценки аттрактивных или репульсивных реакций аксонов.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как культура диссоциированных клеток или культура двух эксплантатов DX, является то, что коллагеновый матрикс обеспечивает трехмерный субстрат для экзонов, имитирующий внеклеточную среду. Кроме того, коллагеновый матрикс позволяет формировать относительно стабильные градиенты белков, высвобождаемых эксплантатами X или клетками, расположенными поблизости. Демонстрировать процедуру будут Ава Смит и Франческа, еще два аспиранта из моей лаборатории.

Для начала данной процедуры извлеките эмбрионы мыши на стадии E 14.5 из матки матери. Храните их в среде L 15 на льду до начала использования. Затем перенесите эмбрион под микроскоп и изолируйте мозг из эмбриона.

Затем удалите цефалон, сделав надрезы вдоль медиальной части каждой цефалической везикулы. После этого удалите оболочку мозговых оболочек. Сделайте дорсовентральный разрез чуть ростральнее медиального головного изгиба.

Затем сделайте еще один дорсовентральный разрез чуть каудальнее цефалического сгиба. После этого с помощью ножа для микродиссекции сделайте рострокаудальный разрез вдоль дорсальной срединной линии, чтобы обнажить подлежащую ткань вентральной части среднего мозга. Будьте осторожны, чтобы не повредить ткань вентрального среднего мозга, так как в ней расположены дофаминергические нейроны.

После этого сделайте два ростральных разреза в направлении коддла, латерально и параллельно вентральной срединной линии, чтобы удалить ткани дорсальной части среднего мозга. Затем, используя нож для микродиссекции, разделите оставшуюся вентральную ткань среднего мозга на X эксплантатов в конце процедуры. Храните X эксплантатов в среде L 15 с добавлением 5% FBS на льду до начала использования.

Теперь перенесите полученные ранее в ходе диссекции среднего мозга головные пузыри путового тела под микроскоп. Удалите таламус, произведя разрез между таламусом и стриатумом с помощью пинцета. Затем сделайте медиально-латеральный разрез ростральнее стриатума, чтобы удалить ростральные структуры, такие как обонятельная луковица.

Затем повторите этот шаг для ткани, расположенной рядом со стриатумом. После этого установите оставшийся срез таким образом, чтобы получить корональный вид стриатума. Стриатум можно распознать как чуть более прозрачную часть ткани.

Затем изолируйте стриатум и с помощью ножа для микродиссекции нарежьте его на имплантаты. Избегайте захвата более темной ткани, расположенной близко к срединной линии, которая содержит мигрирующие нейроны латерального и медиального ганглионарных выбуханий. Добавьте каплю приготовленного коллагена на покровное стекло в лунку четырехлуночного планшета.

Выдержите в инкубаторе при 37 °C и 5% carbon dioxide в течение 30 минут. В ходе этой инкубации коллаген перейдет в состояние желатина. После того как коллаген желатинизируется, с помощью пипетки с наконечником на 200 µL перенесите эксплантаты дофаминергических нейронов или SAL в коллаген.

Затем с помощью иглы переместите экспланты так, чтобы они находились в непосредственной близости друг от друга. Соблюдайте расстояние между ними, примерно равное диаметру одного экспланта. После этого удалите излишки среды.

Добавьте 20 µL приготовленного коллагена поверх эксплантата. Это часто приводит к смещению эксплантатов. С помощью иглы верните эксплантаты в исходное положение.

Дайте коллагену затвердеть при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем перенесите его в инкубатор при 37 °C с подачей 5% carbon dioxide на 30 минут. После застывания коллагена добавьте 400 µL среды для эксплантатов и культивируйте в течение двух-трех дней в инкубаторе при 37 °C.

Для бережной фиксации эксплантатов добавьте 4% параформальдегид и выдержите их при комнатной температуре в течение одного часа. По истечении часа промойте их в PBS при комнатной температуре трижды, по 15 минут за каждую промывку.

Затем, после удаления PBS, инкубируйте их в блокирующем буфере в течение двух часов. После этого инкубируйте их в течение ночи с первичными антителами и блокирующим буфером при температуре 4 °C. На следующий день промойте их в PBS пять раз при комнатной температуре, по одному часу на каждую промывку. Затем инкубируйте их со вторичными антителами, конъюгированными с соответствующим флуорофором.

Выдержите в блокирующем буфере в течение ночи при температуре four degrees Celsius. Начиная с этого этапа, накройте экспланты алюминиевой фольгой, чтобы минимизировать их воздействие света. Промойте их в PBS в течение ночи при температуре four degrees Celsius, после чего на следующий день проведите несколько промывок.

Затем зафиксируйте экспланты на предметном стекле микроскопа, используя антифейдинговый агент для длительного сохранения, обратив сторону с эксплантом вниз. Осторожно накройте среду закрепления покровным стеклом, чтобы под ним не образовались пузырьки воздуха. После этого получите цифровые изображения x эксплантов с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.

Используя эти изображения, разделите каждый эксплантат X на квадранты, чтобы выделить проксимальный и дистальный квадранты. После этого измерьте длину 20 самых длинных нейритов, выходящих из эксплантата X, как в проксимальном, так и в дистальном квадрантах. Используйте среднюю длину 20 самых длинных нейритов для расчета соотношения проксимальной и дистальной зон для каждого отдельного эксплантата.

Отношение проксимального показателя к дистальному, превышающее единицу, указывает на аттракцию аксонов. В то время как отношение меньше единичного указывает на репульсию аксонов. Здесь представлен срез среднего мозга, окрашенный антителами к тирозингидроксилазе, демонстрирующий рост аксонов.

Пунктирная линия указывает на соседние эксплантаты. Стрелки здесь указывают на отдельные нейриты и конусы роста. Здесь представлен пример количественного определения проксимально-дистального соотношения.

Они разделены на равные квадранты. Проксимальный квадрант обращен к соседним эксплантам X, а дистальный — от них. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить совместное культивирование дофаминергических и стриатальных эксплантов для исследования развития мезоаксонального и нигростриального путей, а также для изучения молекулярных механизмов, участвующих в формировании этих путей.