Индукционная трансплантат против хозяина и В Vivo Т-клеток Мониторинг Использование MHC соответствием мышиной модели

Целью данной процедуры является изучение моделей транспортировки и накопления Т-клеток во время заболевания «трансплантат против хозяина». Это достигается путем выделения костного мозга и цитов от донорских мышей. Второй шаг – очистка интересующих клеточных популяций и подготовка их к трансплантации.

Затем очищенные клеточные популяции объединяют и пересаживают облученным мышам-реципиентам. Последним шагом является визуализация моделей транспортировки и накопления Т-клеток у мышей-реципиентов. В конечном счете, биолюминесцентная визуализация используется для демонстрации моделей транспортировки и накопления Т-клеток во время РТПХ.

Основное преимущество биолюминесцентной визуализации перед существующими технологиями заключается в том, что она позволяет обнаруживать лимфоциты по всей длине мыши, а не на определенном участке, как при использовании существующих технологий для реципиента. Мышей необходимо лечить с помощью смертельного облучения перед трансплантацией костного мозга и цитов. Поместите до 10 мышей-реципиентов в микроизоляторную клетку, совместимую с используемым облучателем.

Затем облучите мышей либо источником цезия 1 37, либо RS 2000, излучателем с начальной дозой 4,5 градуса по Цельсию. Через три часа снова облучите мышей 4,5 градусами по Цельсию, чтобы получить в общей сложности девять градусов радиации. После второй дозы мышей-реципиентов хранят в микроизоляторе с подкисленной водой с pH 3 до момента трансплантации.

Подкисленная вода поможет контролировать оппортунистические поражения у реципиентов для получения PLE-цитов. Разрежьте кожу усыпленной донорской мыши, сделав вертикальный двухсантиметровый разрез примерно в двух сантиметрах справа от средней линии непосредственно под грудной клеткой, чтобы локализовать селезенку. Затем удалите селезенку и поместите ее в зеленую ячейку объемом 40 микролитров в чашке Петри, содержащей 1640 оборотов в минуту с 5% FBS.

Чтобы приготовить одноклеточную суспензию, используйте поршень шприца, чтобы разбить селезенку на части, пока вся селезенка не пройдет через сетчатое сито. Повторите этот процесс для каждого типа вайлда и люксовой положительной мыши-донора. Соберите все одноклеточные суспензии дикого типа в одну коническую пробирку объемом 50 миллилитров, а все роскошные положительные одноклеточные суспензии соберите в отдельной конической пробирке объемом 50 миллилитров.

После того, как суспензии будут собраны в соответствующих пробирках, центрифугируйте ячейки и суспензируйте гранулы при 1640 об/мин с 5% FBS. Затем посчитайте ячейки.

Снимите кожу с одной задней конечности мыши-донора и аккуратно отрежьте как можно больше мышечной ткани от бедренной и малоберцовой костей с помощью прочных ножниц. Отрежьте бедренную кость в тазобедренном суставе, чтобы удалить заднюю конечность. Затем отрежьте заднюю пору чуть ниже места введения малоберцовой кости.

Аккуратно удалите остатки мышечной ткани и отрежьте малоберцовую кость. В малоберцовой кости мало костного мозга, поэтому его можно выбросить. Затем поместите заднюю конечность в холодную 1640 RPMI с 5% раствором FBS и повторите процесс для второй задней конечности.

Храните задние конечности в среде, пока не будут удалены все задние конечности. Каждая мышь должна давать от 20 до 6 до 40 10 до шести клеток костного мозга. Чтобы подготовиться к удалению костного мозга, возьмите одну заднюю конечность из холодной среды R-P-M-I-F-B-S и поместите ее в большую чашку Петри, содержащую один миллилитр холодной среды.

Отрежьте коленные суставы от каждой задней конечности. Затем прикрепите подкожную иглу 27-29 калибра к шприцу объемом 10 миллилитров и поместите иглу в большеберцовую кость. Нажимайте на шприц до тех пор, пока весь красный материал не будет удален из внутренней части большеберцовой кости.

Повторите этот процесс с бедренной костью. Выбросьте все оставшиеся кости, лишенные костного мозга. Повторите этот процесс со второй задней конечностью.

Пипеткой нанесите среду, содержащую костный мозг, в большую чашку Петри. Для того чтобы приготовить одноклеточные суспензии с помощью шприца, поршня и сетчатого сита объемом 40 микролитров, разбить костный мозг на части до тех пор, пока он полностью не пройдет через сито. Далее пипеткой наведите одноклеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и поместите эту пробирку на ледяную истощительную CD три положительные клетки из костного мозга в соответствии с протоколом производителя.

Как только костный мозг истощен CD, три положительные клетки промывают оставшиеся клетки центрифугированием SP-цитов, и клетки костного мозга не объединяют циты и клетки костного мозга. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Далее удалите всю супинатную ткань Риза.

Суспензируйте клетки костного мозга в максимальном буфере 100 микролитров на 10 миллионов клеток костного мозга. Продолжайте с истощением CD три, используя протокол производителя. Далее промывайте CD три истощенные клетки костного мозга три раза в стерильном PBS.

Подсчитайте клетки и ресуспендируйте их в подходящий объем, чтобы ввести 10 из семи клеток. Ресуспендируйте гранулы дикого типа в 90 микролитрах максимального буфера на 10-7 клеток. Продолжайте с истощением CD восьми Т-клеток.

Согласно протоколу производителя, ресуспендируйте люксовую положительную гранулу в 40 микролитрах максимального буфера на 10 до семи ячеек. Продолжайте очистку CD восемью Т-клетками. Согласно протоколу производителя, подсчитайте каждую популяцию клеток и промойте каждую популяцию три раза одним миллилитром стерильного PBS, ресуспендируйте каждую популяцию в соответствующем объеме для введения 18 раз 10 в шесть cd, восемь истощенных PLE-цитов дикого типа и два раза по 10 в шесть L, два G 85 B, шесть очищенных CD, восемь Т-клеток для подготовки к инъекции.

Сначала соедините 10 из семи CD три истощенных клеток костного мозга 18 раз по 10 с шестью истощенными цитами типа CD и два раза по 10 с шестью L, двумя G 85 B 6 люкс положительными очищенными CD восемью Т-клетками в микроцентрифужной пробирке. Затем промойте объединенные клетки стерильными PBS и Resus. Суспензируйте их в 300 микролитрах стерильного PBS.

Затем с помощью иглы 28 калибра введите клеточный препарат в хвостовую вену мыши-реципиента. Мышей-реципиентов хранят в микроизоляторе с подкисленной водой. Ежедневно оценивайте мышей с помощью системы оценки РТПХ, показанной в таблице 1.

После инъекции люцифериана мышам и визуализации мышей под наркозом в течение пяти минут при низком уровне наклона, проанализируйте данные с помощью программного обеспечения для работы с живыми изображениями. Области интереса могут быть созданы с помощью программного обеспечения для работы с живыми изображениями, а излучение света может быть количественно определено путем вычисления потока, испускаемого каждой областью интереса. Вот система оценки GVHD, разработанная компанией Cook Etol в 1996 году.

Мышей следует ежедневно оценивать по каждому левому критерию. Каждой мыши присваивается оценка от нуля до двух по каждому критерию, а общая оценка представляет собой сумму всех отображаемых индивидуальных оценок. Ниже приведены клинические показатели и данные о выживаемости мышей-реципиентов, которым было пересажено от 10 до 7 клеток костного мозга в отдельности или в 18 раз по 10 к шести CD с восемью Т-клетками истощенного дикого типа и в два раза по 10 к шести очищенным свободно-положительным CD восьми Т-клеткам.

Здесь представлены данные клинической оценки для реципиентов только костного мозга или с CD восемью Т, истощенными Т-клетками дикого типа и очищенными свободными положительными CD восемью Т-клетками, здесь показаны данные о выживаемости реципиентов только костного мозга или реципиентов с CD восемью Т-клетками, истощенными BLE дикого типа и свободными положительными CD восемью Т-клетками. Это биолюминесцентные изображения мышей-реципиентов после инъекции четырех миллиграммов D Люцифера и визуализации с помощью Enogen IVIS в течение пяти минут при небольшом вращении. Отображаются псевдоцветные изображения, где фиолетовый цвет представляет низкую интенсивность, а красный — высокую интенсивность.

Области интереса были нарисованы вокруг всей мыши и общий поток или количественно определены. Здесь показано биолюминесцентное изображение мышей-реципиентов после инъекции четырех мг d Люцифера, а также изображение с помощью эногена IVIS в течение пяти минут при небольшом вращении. Как и на предыдущем изображении, показаны псевдоцветные изображения, где фиолетовый цвет представляет низкую интенсивность, а красный — панели высокой интенсивности.

А, В и С представляют визуализацию на четвертый, шестой и восьмой дни после переноса соответственно. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как проточная цитометрия, для дальнейшей характеристики Т-клеток, которые проникают в кишечник.