Оценка Тератогенные Изменения в модели данио рерио внутриутробного развития плода алкоголь

Общая цель данной процедуры — изучение влияния воздействия этанола на развивающихся личинок данио-рерио. Сначала эмбрионы данио-рерио подвергаются воздействию доз этанола в стандартной воде для эмбрионов на ранних стадиях развития. Затем этанол удаляют, и рыбам дают развиваться до необходимой временной точки.

Затем в обработанных эмбрионах по сравнению с контрольными анализируют как общие физические изменения, так и изменения экспрессии генов. В завершение эмбрионы подвергают воздействию мРНК, морфолино или препаратов, чтобы определить, можно ли изменить индуцированные этанолом пороки развития. В конечном итоге комбинация количественной ПЦР и гибридизации in situ показывает, что воздействие этанола на развивающиеся эмбрионы данио-рерио связано с изменением экспрессии генов.

Последующее манипулирование уровнями экспрессии генов может улучшить состояние или предотвратить развитие дефектов развития, вызванных этанолом. Методы, которые мы демонстрируем сегодня, расширяют наши знания о природе фетального алкогольного синдрома, а также о сохранении процессов развития у позвоночных. Сегодня демонстрировать воздействие этанола на эмбрионы будет Стеф Эрхардт, техник моей лаборатории.

Выращивайте эмбрионы, полученные в результате скрещивания особей дикого типа, до стадии купола при температуре 28 °C в воде для эмбрионов. Распределите эмбрионы из одной кладки по нужному количеству чашек, помещая от 10 до 50 эмбрионов в каждую чашку. Добавьте к эмбрионам раствор этанола в концентрации от 0,2 до 2,5% об. в воде для рыб и верните их в инкубатор на время до 24 часов после истечения требуемого периода воздействия.

Замените этанол, содержащий воду, на свежую воду для эмбрионов на определенный период развития для сбора мРНК для количественной ПЦР. Поместите соответствующие эмбрионы H в микроцентрифужные пробирки. Удалите воду с рыбами и добавьте лизирующий буфер с TCEP.

С помощью моторизованного измельчителя физически дезинтегрируйте эмбрионы, затем поместите их в центрифугу для медленного центрифугирования. Перенесите раствор в колонку для предварительной очистки, после чего центрифугируйте колонку. Это необходимо для удаления крупных отделенных фрагментов.

Используйте набор для выделения РНК для экстракции РНК. Затем синтезируйте кДНК стандартными методами для количественной ПЦР или микрочипового анализа, чтобы подготовить эмбрионы к гибридизации in situ и иммуногистохимическому окрашиванию. Фиксируйте эмбрионы в возрасте от 6 до 24 часов после оплодотворения в 4% параформальдегиде в течение ночи при 4 °C, после трехкратной промывки в PBS с добавлением 0,1% Tween.

С помощью двух острых пинцетов под микроскопом удалите хорион. Затем перенесите эмбрионы в метанол, используя серию последовательных замен раствора с постепенным увеличением концентрации метанола и снижением концентрации PBT. После переноса эмбрионов в 100% метанол храните их при температуре -20 °C для окрашивания хрящей.

Выращивайте эмбрионы до пятого или шестого дня после оплодотворения. Фиксируйте их в течение ночи в 4% параформальдегиде при температуре четыре градуса Цельсия. Затем промойте их трижды в PBT, чтобы определить, какие уровни экспрессии генов изменились под воздействием этанола.

Выполните количественную ПЦР (кПЦР), предварительно разработав праймеры для их последующей валидации. Протестируйте их на трех биологических образцах. Эти контрольные биологические образцы могут быть любого возраста, при условии, что интересующий ген экспрессируется в данном конкретном возрасте.

После верификации праймеров используйте ранее подготовленную кДНК для проведения количественной ПЦР (кПЦР), анализируя образцы в трех повторностях и включив контрольный образец; в качестве контроля для Danio rerio мы используем праймеры к gapdh. Нормализуйте результаты по уровням gapdh. Затем рассчитайте относительный уровень экспрессии гена с помощью метода 2⁻ΔΔCt.

Вариация метода двух дельта-дельта CT, демонстрирующая различие между экспериментальной группой и диким типом. На рисунке C представлены две гибридизационные конструкции. Слева показаны меченные рибопробы к исследуемому гену.

Затем инкубируйте их с эмбрионами того же возраста в стандартных условиях и определите характер гибридизации с помощью щелочной фосфатазы; визуализируйте образцы с помощью стереомикроскопа для оценки морфогенетического развития, например, формы тела; сфотографируйте живых эмбрионов для оценки межглазного расстояния и длины тела. Сначала зафиксируйте эмбрионы в параформальдегиде. Затем сделайте снимки, чтобы изучить влияние воздействия алкоголя на развивающиеся хрящевые структуры в окрашенных личинках.

Фиксируйте эмбрионов zebrafish, используя lc и синий свет в течение нескольких часов или в течение ночи, чтобы закрепить и просветлить эмбрионы перед визуализацией. Анализируйте гибель клеток в живых эмбрионов, инкубируя их в растворе acridine orange в PBS в концентрации 5 mg/mL в течение одного часа. Промойте эмбрионы трижды в PBS, затем закрепите эмбрионы на предметных стеклах, получите изображения образцов с помощью конфокального микроскопа и используйте Z-стеки для создания композитных изображений.

После выявления генов, экспрессия которых снизилась под воздействием этанола, введите от 25 до 200 пг/нл кэпированной мРНК интересующего гена в эмбрион на стадии одной или двух клеток. Поместите икринки в инкубатор с подогревом до 28 °C для восстановления до достижения стадии купола, после чего повторите воздействие этанола, как было описано ранее. Для генов, экспрессия которых увеличилась в результате воздействия этанола, проведите нокдаун, введя от пикограммовых до нанограммовых количеств антисмысловых морфолино в эмбрионы на стадии одной или двух клеток.

Данный протокол аналогичен протоколу для кэпированной мРНК. При введении мРНК или сплайсинг-морфолино измерьте эффективность с помощью R-T-P-C-R, чтобы сравнить количество сплайсированных и несплайсированных транскриптов для анализа дозозависимой активности гена; титруйте вводимый морфолино и дождитесь развития эмбрионов до нужной стадии перед воздействием этанола. Воздействие этанола на эмбрионы zebrafish приводит к ряду пороков развития и генетических дефектов, которые соотносятся с фенотипами, обнаруживаемыми у других позвоночных.

Аномальное развитие осевых тканей, включая область Noor, приводит к укорочению и иногда разрыву ноорда, что частично вызывает последующие аномалии сомитов, показанные здесь. В то время как необработанные контроли имеют выраженную форму шеврона, сомиты, подвергшиеся воздействию этанола, приобретают U-образный вид, характерный для снижения передачи сигналов sonic hedgehog. Как видно здесь.

Другим последствием воздействия этанола, возможно, развивающимся вследствие ранней задержки развития и последующих дефектов Ноора, является сокращение длины эмбриона. Этот результат схож с сохранением признаков препубертатного периода и низким ростом у детей, подвергшихся воздействию этанола в during развития, что свидетельствует о релевантности модели zebrafish для понимания этого врожденного порока развития у человека. На животных моделях было продемонстрировано, что сильное воздействие этанола приводит к выраженным фенотипам фетального алкогольного синдрома, включая синтию и опию.

У данио-рерио межглазное расстояние (IOD) сокращается в зависимости от дозы этанола, что согласуется с характером врожденного порока развития у человека. Опия наблюдается только при очень высоких дозах, однако более низкие дозы приводят к значимому сокращению IOD, что свидетельствует о наличии в данной животной модели схокого дефекта развития срединных структур лица. На данном рисунке сравниваются уровни ранней экспрессии генов six3B и glee1 в эмбрионах, не подвергавшихся воздействию этанола, и в эмбрионах, подвергшихся воздействию этанола.

В обоих генах наблюдалось снижение уровня экспрессии в образцах, обработанных этанолом. С помощью гибридизации NC два были проанализированы паттерны экспрессии six 3 B и gooID, как показано далее. Здесь оба гена продемонстрировали снижение пространственной экспрессии в эмбрионах, обработанных этанолом, по сравнению с необработанным контролем.

Поскольку оба гена экспрессируются в тканях, которые в дальнейшем становятся тканями срединной линии черепа, их снижение через восемь часов после оплодотворения согласуется со снижением IOD на более поздних стадиях развития. После того как идентифицированы гены, на которые влияет этанол, становятся доступны механизмы, позволяющие увеличить или уменьшить их экспрессию. В данном примере была проведена инъекция мРНК sonic hedgehog — лиганда, который повышает уровни glee one, что позволило устранить грубые дефекты, вызванные снижением glee one в эмбрионах, подвергнутых воздействию этанола.

Инъекция six three B, однако, не смогла восстановить фенотип, вызванный воздействием этанола. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как исследовать генетические и пороки развития, вызванные этанолом у развивающегося эмбриона данио-рерио. Методы, использованные здесь, также могут быть применены теми, кто хочет изучить токсичность других водорастворимых соединений для развивающегося эмбриона позвоночных.