Мышь Криоконсервация спермы и восстановление использованием I · Cryo Kit

Общей целью этой процедуры является криоконсервация спермы мыши. Это достигается путем сбора спермы из мышиных ЭПИ с помощью соломинок для криоконсервации. Затем соломинки замораживают в жидком азоте, где они хранятся до тех пор, пока не будут восстановлены, размораживая их в теплой воде.

Восстановленная сперма мыши в конечном итоге используется для экстракорпорального оплодотворения. Основным преимуществом этого набора перед существующими методами является то, что набор содержит все необходимые материалы, необходимые для криоконсервации и восстановления спермы мыши. Начните со сборки 15 соломинок для криоконсервации спермы на линию мышей, подлежащих криоконсервации.

Сначала подсоедините каждую 0,25-миллилитровую соломинку к одномиллилитровому шприцу ватной пробкой, ближайшей к шприцу. Во-вторых, загрузите в каждую соломинку по восемь сантиметров среды для ЭКО, а затем один сантиметр воздуха. В-третьих, пометьте каждую из 15 соломинок названием линии, которую необходимо сохранить для каждой линии, подлежащей криоконсервации.

Наполните лунку из четырех лунок 240 микролитрами криозащитного средства. Приложите пипетку объемом в один миллилитр к ручке канистры для заморозки, чтобы удлинить ручку. Наконец, наполните поролоновую изоляцию коробки, входящей в комплект, 15 сантиметрами жидкого азота и закройте крышку для эвтаназии.

Два фертильных взрослых самца мышей. Чтобы каждая линия была крионирована и подвергнута хирургическому лечению, удалите их кодальные EPI. Поместите мышь в спинную часть и откройте брюшную стенку тела.

Осторожно потяните за обширный поклон и удалите лишний жир. Затем найдите придаток яичка и удалите его в целости и сохранности с помощью небольшого кусочка быстрого почтения. Поместите ЭПИ в лунку из подготовленной четырехлуночной чашки, загруженной CPA под препарирующим эндоскопом.

Сделайте пять-семь продольных надрезов в каждом придатке яичка. Затем с помощью щипцов аккуратно сожмите каждую быструю разницу. Чтобы вытолкнуть сперматозоиды, инкубируйте смесь CPA и придатка яичка при комнатной температуре в течение трех-пяти минут.

Аккуратно перемешивайте блюдо рукой два-три раза за время инкубации. Это позволит сперматозоидам выплыть путем аспирации. Загрузите в каждую подготовленную соломинку пять миллиметров сперматозоидной суспензии, а затем один сантиметр воздуха.

Для процесса заморозки важно, чтобы все соломинки были загружены одинаково. Загрузив все 15 соломинок, тщательно запечатайте оба конца каждой соломинки. Чтобы обеспечить выживание сперматозоидов, завершите процесс для всех 15 соломинок в течение 10 минут.

Как только все соломинки будут подготовлены, загрузите их в столб спермы морозильной канистры. Сначала поместите канистру в коробку с пенопластом и дайте ей вертикально плавать в жидком азоте. В течение 10 минут канистра должна плавать вертикально, иначе скорость замерзания спермы будет снижена.

Затем погрузите канистру в жидкий азот. Таким образом, сперма криоконсервируется и готова к длительному хранению жидкого азота. Примерно за 60 часов до планового восстановления сперматозоидов.

Следуйте письменному протоколу для суперовуляции у самок перед ЭКО. Чтобы каждая соломинка размораживалась, подготовьте и уравновесьте все среды в течение как минимум одного часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Эти материалы включают в себя 35-миллиметровую чашку Петри с каплей 90 микролитров среды для обработки спермы, покрытую маслом.

35-миллиметровая чашка Петри с тремя миллилитрами среды для ЭКО служит в качестве режущей тарелки, и на каждые пять суперовулированных женщин готовят чашку для ЭКО, которая представляет собой одну лунку из четырех лунок, загруженную 500 микролитрами среды для ЭКО. Для каждой чашки для ЭКО подготовьте посуду для мытья, которая представляет собой 35-миллиметровую чашку Петри с тремя миллилитрами КСОМ и чашку для культивирования эмбрионов, которая представляет собой 35-миллиметровую чашку Петри с 50 микролитрами капель среды КСОМ, залитую маслом. Со всеми необходимыми материалами быстро достаньте соломинку из хранилища и поместите ее на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на две-три минуты.

Обсушите солому. Затем сделайте наклонный надрез в воздушном столбе ниже ватной пробки. На другом конце соломы сделайте еще один наклонный надрез над другим воздушным столбом.

Избегайте разрезания столбика сперматозоидов. Теперь аспирируйте сперматозоидную суспензию с конца соломинки, используя пипетку объемом 200 микролитров, и поместите ее в центр среды для обработки спермы. Капля. Затем выдержите блюдо в течение 45 – 60 минут.

Во время инкубации сперматозоидов изолируйте ucs суперовулированных самок и перенесите их в чашку для разделки. С помощью иглы 30 калибра или щипцов разорвите каждый яйцевод, высвобождая комплексы кумулюсных цитов. Переносите C C от пяти женщин в каждое ЭКО.

Ну, с минимальным количеством носителей. Избегайте переноса жира и крови, так как грязная среда препятствует эффективности оплодотворения. После инкубации соберите от 10 до 15 микролитров сперматозоидной суспензии с периферии капли STM и поместите суспензию в одну операцию ЭКО.

Теперь сокультивируйте клетки в течение четырех-шести часов для оплодотворения. После оплодотворения пропустите эмбрионы через не менее 2K SOM в посуде для мытья. Затем культура.

Эмбрионы в КСОМ до достижения желаемой стадии развития. Сперма пяти инбредных линий мышей Charles River была заморожена. Защитные отношения подвижности сперматозоидов и быстрой прогрессирующей подвижности варьировались от 81% до 47% для пяти штаммов этих сперматозоидов.

Показатели ЭКО с замороженной размороженной спермой варьировали у разных штаммов от 26 до 88% в течение полутора лет. В общей сложности 49 линий ГМ-мышей были архивированы с помощью криоконсервации спермы, а затем восстановлены с помощью ЭКО в четырех различных женских линиях. C 57 black six BC DBA one and 1 29 SV После освоения техника криоконсервации спермы может быть выполнена за 30 минут, если она выполнена правильно.

Для этой процедуры важно подать в канистру вертикально и жидкий азот.