Мышь Криоконсервация спермы и восстановление использованием I · Cryo Kit
12 декабря 2011 г.
Здесь мы показываем, недавно разработанный я • Крио комплект для криоконсервации спермы мыши. Два-клеточной стадии развития эмбриона с замороженной спермы талой была улучшена последовательно в 5 мышей штаммы с использованием этого комплекта. За 1,5 лет, 49 линий генетически модифицированных мышей были заархивированы спермой криоконсервации с I • Крио комплект, а затем успешно извлечены с помощью ЭКО.
Общая цель данной процедуры заключается в криоконсервации спермы мыши. Это достигается путем предварительного сбора сперматозоидов из эпидидимисов (EPI) мыши с использованием криоконсервационных соломинок. Затем соломинки замораживают в жидком азоте, где они хранятся до момента их восстановления путем размораживания в теплой воде.
Восстановленные сперматозоиды мыши в конечном итоге используются для ивн. Основным преимуществом данного набора перед существующими методами является то, что он содержит все необходимые материалы для криоконсервации и восстановления сперматозоидов мыши. Как правило, специалисты, которые только начинают осваивать этот метод, могут испытывать трудности с манипуляциями и загрузкой соломинок. Начните со сборки 15 соломинок для криоконсервации спермы на каждую линию мышей, подлежащую криоконсервации.
Сначала подсоедините каждую соломинку объемом 0.25 milliliter к одномиллилитровому шприцу так, чтобы хлопковая пробка находилась ближе к шприцу. Затем наберите в каждую соломинку 8 centimeter среды для ЭКО, после чего добавьте 1 centimeter воздуха. В завершение подпишите каждую из 15 соломинок названием линии, которая подлежит криоконсервации.
Наполните лунку планшета на четыре лунки 240 µL криопротектора. Прикрепите пипетку объемом 1 мл к ручке контейнера для замораживания, чтобы удлинить её. Наконец, наполните прилагаемый к набору короб с пенопластовой изоляцией жидким азотом до уровня 15 см и закройте крышку для эвтаназии.
Две фертильные взрослые мыши-самцы. Для каждой линии, подлежащей криоконсервации, хирургическим путем удалите их придатков эпидидимуса (EPI). Поместите мышь в положение на спине и вскройте брюшную стенку.
Осторожно потяните за вас деференс и удалите излишки жировой ткани. Затем найдите придаток семенника (эпидидимис) и удалите его целиком вместе с небольшим фрагментом вас деференса. Под бинокулярным микроскопом поместите придатки в лунку подготовленного четырехлуночного планшета, заполненного CPA.
Сделайте от пяти до семи продольных разрезов в каждом придатке семенника. Затем с помощью пинцета осторожно сожмите каждый разрез. Чтобы вытеснить сперматозоиды, инкубируйте смесь CPA и придатка семенника при комнатной температуре от трех до пяти минут.
В процессе инкубации осторожно встряхните чашку вручную два или три раза. Это позволит сперматозоидам выплыть за счет аспирации. Наберите в каждый подготовленный соломинку пять миллиметров суспензии сперматозоидов, оставив после этого один сантиметр воздуха.
Для процесса замораживания важно, чтобы все соломинки были заполнены равномерно. После заполнения всех 15 соломинок осторожно запаяйте оба конца каждой из них. Для обеспечения выживаемости сперматозоидов завершите этот процесс для всех 15 соломинок в течение 10 минут.
После подготовки всех соломинок загрузите их в колонну для спермы в канистре для замораживания. Сначала поместите канистру в пенопластовый короб и дайте ей свободно плавать вертикально в жидком азоте. Канистра должна находиться в вертикальном положении в течение 10 минут, иначе скорость замораживания спермы изменится.
Затем погрузите контейнер в жидкий азот. Таким образом сперма криоконсервируется и становится пригодной для длительного хранения в жидком азоте. Примерно за 60 часов до планируемого извлечения спермы.
Следуйте письменному протоколу для проведения суперстимуляции овуляции у самок перед ЭКО. Для каждой соломинки, подлежащей разморозке, подготовьте и уравновесьте все среды в течение как минимум одного часа при 37 °C и 5% carbon dioxide. Эти материалы включают чашку Петри диаметром 35 мм с каплей среды для обработки спермы объемом 90 µL, покрытой маслом.
Подготовьте чашку Петри диаметром 35 мм с 3 мл среды для IVF, которая будет использоваться в качестве чашки для разрезания, а также одну лунку четырехлуночного планшета с 500 мкл среды для IVF на каждые пять суперэовулированных самок. Для каждой такой лунки подготовьте чашку для промывки (чашка Петри 35 мм с 3 мл среды KSOM) и чашку для культивирования эмбрионов (чашка Петри 35 мм с каплями среды KSOM объемом 50 мкл, покрытыми маслом). После подготовки всех необходимых материалов быстро извлеките соломинку из места хранения и поместите её в водяную баню с температурой 37 °C на 2–3 минуты.
Просушите соломинку. Затем сделайте косой срез в воздушном столбе под ватным тампоном. На другом конце соломинки сделайте еще один косой срез над другим воздушным столбом.
Избегайте разрыва столба спермы. Теперь аспирируйте суспензию спермы с конца соломинки, используя пипетку объемом 200 µL, и перенесите ее в центр капли среды для обработки спермы. Затем инкубируйте чашку в течение 45–60 минут.
Во время инкубации сперматозоидов изолируйте яйцеводы суперовулированных самок и перенесите их в чашку для препарирования. С помощью иглы 30-го калибра или пинцета надрежьте каждый яйцевод, чтобы высвободить комплексы кумулюс-ооцитов. Перенесите комплексы кумулюс-ооцитов от пяти самок в каждую чашку для IVF.
Затем, используя минимальный объем среды, перенесите сперматозоиды. Избегайте переноса жира и крови, так как загрязненная среда снижает эффективность оплодотворения. После инкубации соберите от 10 до 15 µL сперматозоидной суспензии с периферии капли STM и внесите суспензию в одну каплю для IVF.
Теперь проведите совместное культивирование клеток в течение четырех-шести часов для оплодотворения. После оплодотворения промойте эмбрионы в чашке для промывки, используя как минимум 2K SOM не менее двух раз. Затем приступайте к культивированию.
Эмбрионы содержали в среде KSOM до достижения желаемой стадии развития. Была проведена заморозка спермы пяти инбредных линий мышей Charles River. Коэффициенты сохранения подвижности и активной прогрессивной подвижности сперматозоозоидов в пяти исследованных линиях варьировали от 81% до 47%.
Показатели ЭСВ с использованием размороженной спермы варьировали в зависимости от линии от 26 до 88% в течение полутора лет. В общей сложности 49 линий ГМ-мышей были архивированы путем криоконсервации спермы и впоследствии восстановлены с помощью ЭСВ на четырех различных линиях самок: C57BL/6, BC, DBA/1 и 129SV. После освоения техники криоконсервации спермы процедура может быть выполнена за 30 минут при условии правильного ее проведения.
При выполнении данной процедуры важно, чтобы поток в контейнер был вертикальным и состоял из жидкого азота.
Обзор
В данном исследовании представлен набор I•Cryo для эффективной криоконсервации спермы мышей, продемонстрировавший улучшение развития эмбрионов у нескольких линий мышей. Набор облегчает архивацию генетически модифицированных линий мышей путем криоконсервации спермы и последующего восстановления с помощью IVF.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Репродуктивная биология
- Методы криоконсервации
- Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО)
Теоретическая основа
- Криоконсервация спермы мышей имеет решающее значение для генетических исследований.
- Существующие методы могут отличаться низкой эффективностью и сложностью в использовании.
- Набор I•Cryo предназначен для оптимизации процесса криоконсервации.
- Успешное восстановление сперматозоидов необходимо для достижения положительных результатов ЭКО.
Цель исследования
- Оценить эффективность набора I•Cryo для криоконсервации спермы мышей.
- Оценить влияние криоконсервированной спермы на развитие эмбрионов.
- Архивировать генетически модифицированные линии мышей для дальнейших исследований.
Используемые методы
- Сбор спермы из придатка семенника мыши с использованием криосоломинок.
- Замораживание спермы в жидком азоте для длительного хранения.
- Размораживание спермы для использования в процедурах ЭКО.
- Оценка подвижности сперматозоидов и показателей успеха ЭКО для различных линий.
Основные результаты
- Улучшенное развитие эмбрионов наблюдалось у 5 линий мышей при использовании набора I•Cryo.
- Успешно архивировано и восстановлено 49 линий генетически модифицированных мышей.
- Показатели подвижности сперматозоидов в различных линиях варьировали от 81% до 47%.
- Показатели ЭКО при использовании замороженной-оттаявшей спермы варьировали от 26% до 88%.
Выводы
- Набор I•Cryo значительно повышает эффективность криоконсервации спермы.
- Успешное восстановление генетически модифицированных линий подтверждает применимость данного метода в исследованиях.
- Дальнейшая оптимизация метода позволит сократить время обработки.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Криоконсервация спермы мышей представляет собой экономически эффективный и масштабируемый способ архивирования генетически модифицированных линий, что позволяет снизить зависимость от живых колоний животных и минимизировать риски потери линий. Набор I•Cryo повышает уверенность в сохранности линий за счет улучшения подвижности сперматозоидов после размораживания и развития эмбрионов, полученных путем ИКСИ/IVF, для нескольких инбредных линий. Это способствует стратегическому управлению портфелем в доклинических исследованиях, обеспечивая надежное долгосрочное хранение и восстановление ценных моделей заболеваний по мере необходимости.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию генетических моделей за счет обеспечения возможности восстановления сперматозоидов для фенотипического скрининга на основе ИКС (IVF).
- Практическая ценность: Снижает нагрузку по содержанию животных и затраты, связанные с поддержанием живых колоний моделей с низкой пропускной способностью или индуцибельных моделей.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированный источник спермы для проведения согласованных анализов ЭКО, что позволяет воспроизводимо оценивать влияние соединений на оплодотворение и раннее развитие эмбриона.
- Практическая ценность: Ускоряет подготовку к анализу за счет использования криоконсервированной спермы, исключая вариабельность, вызванную индивидуальными различиями между самцами или различиями между партиями свежесобранных образцов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает сохранение генетической целостности моделей заболеваний с течением времени, что позволяет проводить лонгитюдные исследования и поддерживать преемственность экспериментов между поколениями.
- Практическая ценность: Облегчает многоцентровое сотрудничество, позволяя распределять криоконсервированную сперму вместо живых животных, что снижает сложность транспортировки и риски, связанные с биобезопасностью.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочий процесс поиска от раннего создания моделей до доклинической валидации, служа связующим звеном между генетической инженерией и функциональным фенотипированием посредством IVF.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез, обеспечивая возможность восстановления криоконсервированных сперматозоидов для ЭКО, что позволяет оценивать влияние генетических модификаций на фертильность и ранний эмбриогенез.
- Скрининг: позволяет проводить стандартизированные анализы на основе ЭКО с использованием размороженных сперматозоидов, повышая воспроизводимость при оценке функции сперматозоидов, их капацитации и способности к оплодотворению.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных показателей, таких как подвижность сперматозоидов (% прогрессивной подвижности), быстрая прогрессивная подвижность и скорость развития эмбрионов, что служит основой для принятия решений о стабильности модели.
- Трансляционные исследования: связывают генетическую модификацию с результатами развития посредством проведения ЭКО с криоконсервированными сперматозоидами, поддерживая фенотипический скрининг преимплантационных эмбрионов с привязкой к биомаркерам.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу криобанкинга для непрерывного архивирования и восстановления ГМ-линий, сокращая затраты на избыточное повторное выведение линий в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования сохранения моделей, демонстрируя улучшенную подвижность и развитие эмбрионов по сравнению с базовыми методами использования CPA.
- Практическая ценность: стандартизирует рабочий процесс криоконсервации за счет использования компонентов из набора, что снижает вариативность действий пользователя и время обучения.
- Стратегическая ценность: снижает долгосрочные затраты на поддержание штаммов и уменьшает риск необратимой потери линий вследствие неудачного скрещивания, генетического дрейфа или вспышки патогенов.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию ГМ-линий для архивирования с учетом рисков на основе их стратегической ценности, обеспечивая уверенность в возможности их восстановления в будущем.
Особенности реализации
- Требуется техническое мастерство в сборе спермы, работе с соломинками и термической запайкой для обеспечения целостности образцов.
- Зависит от наличия доступа к хранилищу с жидким азотом и оборудования для контролируемого размораживания (водяная баня при 37°C) для обеспечения стабильных показателей после размораживания.
- Необходимы стандартизированные среды для IVF и протоколы суперовуляции для достижения надежных результатов оплодотворения и культивирования эмбрионов.
- Эффективность может варьироваться в зависимости от генетического фона, что требует оптимизации этапов инкубации и промывки для конкретных линий.
- Ограничено необходимостью использования фертильных самок и опытом проведения IVF для восстановления спермы, что ограничивает прямое применение в анализах, основанных на естественном спаривании.
