Аналитические методы пробирного азотной окиси биоактивность

Общая цель данного эксперимента — продемонстрировать, как точно и конкретно обнаруживать метаболиты оксида азота в биологических образцах. Это достигается за счет предварительной обработки образцов крови сразу после сбора, чтобы предотвратить потерю метаболитов или образование артефактов. В то же время выполняется быстрый и эффективный забор тканей для минимизации воздействия гипоксической окружающей среды на метаболиты оксида азота.

Кольца аорты собирают и подвешивают в органной ванне для оценки их эндотелиальной функции. Кроме того, биохимические анализы используются для количественного определения уровней нитратов, нитритов и относительных уровней нитротиолов и других продуктов нитронасыщения в тканях. Используя эти анализы, правильное сравнение экспериментальных и контрольных животных может получить ценную информацию о производстве оксида азота и метаболизме.

Основное преимущество использования этого мультисистемного подхода по сравнению с одиночными методами или анализами заключается в том, что это позволит получить более широкую картину биохимии оксида азота в системах нескольких органов. Таким образом, мы можем начать понимать, какие из этих метаболитов могут иметь прогностическую или диагностическую ценность, и как репертуар метаболитов оксида азота отражает образование и доступность эндотелиального оксида азота. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку каждый шаг в процессе имеет решающее значение для сохранения целостности образца.

Некоторые из этих шагов не очевидны при чтении раздела «Методы» в типичном журнале из-за мелких деталей сбора образцов и извлечения ткани. Демонстрировать эту процедуру будет доктор Хун Цзин. Старший научный сотрудник в моей лаборатории: Для этого протокола имеется человек или подопытное животное для забора крови у подопытных животных, ткани которых также будут исследованы.

Сначала соберите цельную кровь, вставив иглу 25 калибра в нижнюю полую вену. После того, как будет собрано от 500 до 1000 микролитров, перфузируйте животное без остатков крови, вводя физиологический буфер через верхушку левого желудочка и обеспечьте полное замещение крови, поскольку кровь и буфер выходят через нижнюю кровеносную систему. Венозную кровь следует собирать в центрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра, содержащие NEM и EDTA, сразу после забора.

Раскручивайте кровь при 14, 300 RCF в течение семи минут после центрифугирования. Аспирируйте плазму из гранулы эритроцитов с помощью пипетки и перенесите ее в отдельную пробирку. Подготовьте изолированные образцы плазмы для ВЭЖХ, добавив сначала один к одному объем холодного метанола к 50 микролитрам плазменного сбора.

Вихрите, смесь энергично в течение трех-пяти секунд, пока не помутнеет. Затем центрифугируйте смесь при температуре 14, 300 RCF в течение семи минут. Чтобы осаждать белки плазмы, соберите супернат в отдельную пробирку объемом 1,5 миллилитра и храните его при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока его можно будет проанализировать.

Чтобы подготовить плазму к хемилюминесцентному анализу, возьмите оставшийся объем плазмы, который должен составлять от 200 до 400 микролитров, и разделите его на два объема. Приготовьте половину плазмы, добавив 10% объема 5% подкисленного сульфида, и подождите 10 минут. Теперь этот образец готов к анализу CLD.

Приготовьте еще одну половину плазмы, добавив 10% объема 2% хлорида ртути через пять минут. При комнатной температуре добавьте 10% объема подкисленного сульфаниламида. Подождите еще 10 минут и введите этот образец в ХЛД, как плазму.

Гранулы эритроцитов могут быть подготовлены для ВЭЖХ и ХЛД для любого анализа. Начните с смешивания одной части клеточной гранулы с четырьмя частями раствора гипотонического лизиса. Тщательно обработайте смесь вихрем для анализа CLD.

Подготовка к клеткам такая же, как и к плазме. Начните с добавления равного объема метанола. Затем энергично перебивайте смесь в течение трех-пяти секунд, после чего вращайте ее в течение семи минут при температуре 14 300 RCF.

Теперь отведите надосадочную жидкость от пипетки и храните ее при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока она не будет проанализирована с помощью ВЭЖХ для определения уровня метаболитов оксида азота в тканях. В тканях, представляющих интерес у экспериментальных животных, кровь должна быть сначала собрана и подготовлена, как описано в предыдущем разделе, забор тканей должен быть выполнен как обычно, с особым вниманием к скорости и эффективности, чтобы ткани не стали гипоксическими. После сбора гомогенизировали образцы тканей в соотношении один к пяти N-E-M-E-D-T-A, содержащему PBS.

Затем подготовьте гомогенизированные ткани для анализа ВЭЖХ и ХЗЛ, как описано в предыдущих разделах для эритроцитов. После обезболивания взрослой мыши датиловым эфиром и подтверждения того, что она не реагирует на защемление пальца ноги, проведите торакотомию. Разрез по средней линии делается от грудины до области лобка, чтобы обнажить грудную и брюшную полости.

Далее перфузируйте животное насыщенным кислородом буфером Krebs Alite. С помощью шприца 25 калибра введите буфер в верхушку левого желудочка. При этом правое предсердие разрезается, чтобы обеспечить выход для крови.

После перфузии изолируйте брюшную аорту, вырезав и удалив печень, легкие и другие ткани, которые могут покрывать аорту. Далее зажмите сердце парой щипцов и аккуратно отрежьте аорту от задней стенки животного. Поместите сердце и аорту в чашку Петри, наполненную льдом.

Холодный буфер Кребса в блюде. Аккуратно срежьте и очистите аорту от жира и адвентиции. Избегайте повреждения эндотелия внутри сосуда во время очистки.

Поддерживайте медленный метаболизм аорты, чтобы предотвратить гипоксию, переводя его в свежий холодный кислородный буфер каждые пять минут. Теперь с помощью скальпеля разрежьте аорту на трехмиллиметровые кольцеобразные сегменты. Перенесите сегменты в четырехканальную 10-миллилитровую ванну для тканевых органов, загруженную кислородосодержащим буфером Кребса.

С помощью ручки датчика нанесите по 1,5 грамма предварительного напряжения на каждое кольцо аорты. Согласно эмпирическим выводам. 1,5 грамма – это подходящее начальное напряжение для оптимальной вазомоторной функции.

В мышином мониторе и запишите измерение силы с помощью восьмиканального восьмеричного моста и программного обеспечения для сбора данных, дайте кольцам уравновеситься в течение 80 минут, меняя буфер каждые 20 минут, а затем продолжайте экспериментировать. После того, как напряжение тканей уравновесится, добавьте 100 наномолярных ринов фенхеля в каждое кольцо для субмаксимального сокращения. Как только напряжение кольца стабилизируется и уровень тонуса стабилизируется, проведите анализ реакции на дозу агониста эндотелия, такого как ацетилхолин.

От этого будет зависеть выработка оксида азота и степень расслабления сосудов. После реакции дозы на ацетилхолин промойте ванны буфером Кребса и добавьте 100 наномоляров фенхеля в каждую ванну для органов, чтобы сузить сосуды. Опять же, затем определите реакцию гладкомышечных колец на экзогенный источник оксида азота, такой как нитропресс натрия со стороны и без ODQ, ингибитора растворимой гиляциклазы.

Этот тип подхода позволит определить 100% значение релаксации сосудов, а также продемонстрирует сущностную природу растворимой гайлциклазы в опосредовании реакции оксида азота на сосудистую релаксацию. Поскольку ODQ предотвращает релаксацию нитро натрия IDE в ответ на ацетилхолин, аортальные кольца у здоровых мышей расслаблялись, в то время как аортальные кольца у мышей с эндотелиальной дисфункцией демонстрировали сниженную релаксацию из-за снижения выработки оксида азота. Групповые специфические анализы de nitro sation также проводились на контрольных животных на хемилюминесценцию нитритов.

RSNO и RNNO были обнаружены с помощью восстановительного анализа de nitros. Путем вычитания пиковых площадей измеряли уровни нитритов и rsno. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области оксида азота и сосудистой биологии, например, как циркулирующие уровни этих метаболитов оксида азота отражают уровни в тканях и как изменяются метаболиты заболевания при различных заболеваниях?

Определение равновесных концентраций и периода полувыведения этих соответствующих метаболитов оксида азота в нескольких системах органов и на протяжении циркуляции одного животного позволит идентифицировать специфические молекулярные сигнатуры патологических процессов и поможет нам определить новые методы лечения на основе оксида азота, что позволит врачу вооружиться лучшими биомаркерами тяжести или прогрессирования заболевания. Как правило, люди, плохо знакомые с азотной кислотой, испытывают трудности, потому что многие из них достаточно чувствительны, чтобы обнаружить и количественно оценить эти низкие уровни метаболизма триновой кислоты, обнаруженные в биологических образцах. Прежде всего, один неквалифицированный специалист в области искусства, скорее всего, создаст артефакты во время обработки образца, которые приведут к ошибочным данным и их неправильной интерпретации.