Изоляция базальных клеток и подслизистой Клетки Канальные железы от трахеи мыши

Целью данного метода является выделение стволовых клеток из протоков подслизистых желез трахеи мыши для изучения процессов восстановления и регенерации. Сначала трахея извлекается из организма эвтаназированной мыши. Затем трахея очищается, разрезается и подвергается ферментативному расщеплению.

Затем эпителий удаляют механическим путем и подвергают дальнейшему перевариванию для получения суспензии одиночных клеток. После этого клетки окрашивают, сортируют и окончательно подготавливают для использования в анализах in vivo и in vitro. В конечном итоге данный метод может помочь выявить ключевые пути, регулирующие самообновление и дифференцировку стволовых клеток эпителия дыхательных путей.

Эти методы имеют важное значение, поскольку они предоставляют нам модели восстановления и регенерации эпителия дыхательных путей in vitro и ex vivo. Это позволяет изучать как нормальное восстановление дыхательных путей, так и заболевания дыхательных путей, такие как хроническая обструктивная болезнь легких, муковисцидоз и астма. Идея этого метода возникла у нас, когда мы не смогли найти специфические поверхностные маркеры для отделения базальных клеток от стволовых клеток протоков, и поэтому решили удалить поверхностный эпителий вместе с базальными клетками, оставив только клетки протоков. Демонстрация процедур диссекции трахеи.

Процедуры отделения эпителия дыхательных путей, создания суспензии единичных клеток и сортинга будут продемонстрированы. Постдокторант моей лаборатории демонстрирует методы обработки отсортированных клеток в моделях in vitro и ex vivo, а также наш менеджер лаборатории. Начните выполнение данной процедуры с рассечения брюшной стенки эвтаназированной мыши.

Отодвиньте кишечник в сторону, чтобы обнажить брюшную аорту, после чего произведите ее диссекцию. Вскройте грудную клетку, разрезав диафрагму и внутреннюю стенку грудной клетки с обеих сторон, чтобы обнажить сердце и легкие. Продолжите разрез вверх к шее, удаляя жировую ткань и слюнные железы с помощью тонких ножниц, чтобы обнажить трахею.

Удалите тимус и отделите легкое от соединительной ткани, расположенной под ним и позади него. Затем введите пинцет между трахеей и пищеводом, чтобы разделить их. Перережьте трахею в ее верхней части, над местом ее соединения с гортанью.

Затем зажмите трахею пинцетом и отделите ее от места прикрепления. Продолжая движение вниз для извлечения трахеи вместе с блоком сердца и легких, отсеките сердце и легкие в области ворот, чтобы сохранить большую часть правого и левого главных бронхов. Поместите трахею в небольшую чашку Петри со средой для сбора на льду под диссекционным микроскопом.

Используйте очень тонкий пинцет номер пять, венозную трубку и ножницы, чтобы удалить все ткани, прикрепленные к трахее. Сюда относятся лимфатические узлы, жировая ткань вокруг возвратного гортанного нерва, щитовидная железа и оставшиеся легочные сосуды. Особое внимание следует уделить верхней части трахеи, чтобы удалить крупные фрагменты гортанного хряща, не повредив основной массив подслизистых желез, расположенный между перстневидным хрящом и первым трахеальным хрящевым кольцом С1.

Затем разрежьте трахею на верхнюю и нижнюю части между C4 и C5. Раскройте обе части вдоль просвета трахеи. Перенесите нижнюю часть трахеи в микроцентрифужную пробирку объемом 1 мл, а верхнюю часть — в коническую пробирку объемом 15 мл для последующего ферментативного переваривания и получения суспензии единичных клеток.

На следующем этапе процедуры нижняя и верхняя части трахеи обрабатываются для получения суспензий единичных клеток. Хотя эти этапы должны выполняться одновременно, два метода будут продемонстрированы последовательно. Для обработки нижней части трахеи поместите ее в один миллилитр 16 unit dis space в микроцентрифужную пробирку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.

Затем перенесите трахею в новую пробирку, содержащую 0,5 мг/мл DNA one в DMM, и выдержите еще 20 минут при комнатной температуре. После завершения переваривания с помощью тонкого пинцета перенесите ткань в стерильную чашку Петри со свежей collecting medium. Затем под диссекционным микроскопом удалите поверхностный эпителий, осторожно потягивая за эпителиальные пласты, чтобы отделить их от подлежащей базальной мембраны. Далее с помощью пипетки перенесите среду, содержащую отделенный эпителий, в коническую пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 1000 G при 4 °C.

После центрифугирования удалите SNAT и добавьте 0,1%трипсина ЭДТА, затем инкубируйте пробирку в шейкере-инкубаторе при 37 °C в течение 30 минут; по окончании инкубации несколько раз произведите пипетирование вверх-вниз с помощью наконечника на 1000 µL, чтобы разрушить клеточные агрегаты и обеспечить получение суспензии одиночных клеток. Поместите верхнюю часть трахеи в коническую пробирку, содержащую 1 мл 0,15%Проназы, и инкубируйте при 4 °C в течение четырех часов. Перенесите нижнюю часть трахеи в микроцентрифужную пробирку объемом 1 мл, содержащую 1 мл среды с добавлением 16 единиц disc base.

После инкубации осторожно перемешайте содержимое пробирки на вортексе, затем перенесите трахею в свежую collecting medium. Под диссекционным микроскопом убедитесь в полном отслоении поверхностного эпителия. С помощью тонких ножниц измельчите трахею и вскройте отделы подслизистых желез.

Инкубируйте еще один час в 0,15% растворе проназы при комнатной температуре при медленном встряхивании. После удаления проназы центрифугируйте ткани трахеи. Добавьте 0,1% трипсин-ЭДТА и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут с встряхиванием.

Затем отфильтруйте крупные частицы через сито с размером пор 70 micron. После этого промойте сито средой. Пропустите конгломераты переваренных клеток и любые оставшиеся фрагменты желез через иглы калибра 20 gauge, 23 gauge и 26 gauge, используя шприц объемом 10 milliliter.

Повторите процедуру пассирования несколько раз для каждого размера иглы, прежде чем переходить к следующему, более тонкому размеру. Теперь большинство клеток должны находиться в состоянии суспензии одиночных клеток. Профильтруйте суспензию через фильтр с размером пор 40 микрон, затем промойте фильтр средой и центрифугируйте клетки.

Затем ресуспендируйте клетки в соответствующем объеме среды, подсчитайте количество клеток и немедленно приступайте к окрашиванию и сортировке. Возьмите достаточное количество клеток для подготовки неокрашенных и одиночно окрашенных пробирок для компенсации. Затем окрасьте остальные клетки первичными антителами против trop tube и I TGA six в течение 15 минут при комнатной температуре. После инкубации промойте клетки PBS или собирающей средой, очень осторожно удалив супернатант.

Окрасьте осадок клеток соответствующими вторичными антителами. Инкубируйте в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем промойте образец, удалите краситель и ресуспендируйте осадок.

Теперь клетки можно отсортировать с помощью метода флуоресцентно-активированной сортировки клеток. После сортировки клетки можно использовать для изучения механизмов восстановления и регенерации при создании культур, формирующих сферы in vitro. Смешайте 100 µL матригеля с пониженным содержанием факторов роста со 100 µL полной среды, содержащей до 50 000 отсортированных клеток.

Перенесите эту смесь пипеткой в верхнюю камеру 24-луночного планшета Transwell, а в нижнюю камеру внесите 400 µL полной среды; инкубируйте при 37 °C. Заменяйте среду в нижней камере каждые два дня и добавляйте дополнительные 100 µL Matrigel каждую неделю или чаще, если слой станет слишком тонким.

Сферы обычно формируются через семь дней; их можно выращивать в течение нескольких недель или подвергать серийному пассажированию. Для модели in vivo ресуспендируйте осадок отсортированных клеток в полной среде, смешанной с Matrigel в соотношении один к одному, при концентрации от 5 000 до 10 000 клеток на 50 µL. После анестезии мыши-реципиента линии C 57 black six стерилизуйте и выбрейте шерсть на спине, затем в верхней части спины.

Сделайте центральный продольный разрез кожи. Используйте тупой конец лезвия ножниц, чтобы расширить пространство между кожей и спиной грудной стенки с обеих сторон. Осторожно отодвиньте переднюю конечность мыши вверх и назад, чтобы сместить и определить медиальный край лопатки.

Затем с помощью инсулинового шприца объемом 300 мкл введите 50 мкл клеточной суспензии в жировую подушку медиальнее лопатки и латеральнее позвоночника. Должен образоваться пузырек; повторите инъекцию с другой стороны, затем зажимите или зашейте разрез кожи. Через три недели вскройте кожу эвтаназированной мыши, как описано ранее, и вырежьте всю жировую подушку с обеих сторон с захватом окружающих тканей.

Чтобы не пропустить никакие ткани, которые могли сформироваться и распространиться вокруг, зафиксируйте выделенную жировую подушку в PFA и залейте её в парафин, чтобы избежать пропуска или игнорирования структур при нарезке блоков. Сделайте один подготовительный срез толщиной 40 мкм, затем нарежьте срез толщиной 4 мкм.

Поместите образец на предметное стекло, затем изучите его под микроскопом, чтобы определить наличие эпителиальных структур. Если ничего не обнаружилось, проведите подрезку еще раз и повторите этот шаг. Очистка трахеи мыши, описанная в данном видео, приведет к получению обнаженной трахеи, которую можно увидеть при помощи световой микроскопии, как показано здесь denuded tracheas.

Слева показаны результаты переваривания через 30 минут после обработки, а также обнаженные трахеи. Справа показаны результаты переваривания проназой через четыре часа. После удаления эпителия подслизистые железы высвобождаются из тканей и становятся похожими на гроздья винограда.

Удаление поверхностных эпителиальных клеток показано черными стрелками. Удаление клеток в подслизистых железах и протоках показано зелеными стрелками. Проточная цитометрия суспензий одиночных клеток должна демонстрировать графики прямого и бокового светорассеяния, как показано здесь.

Хорошее отделение клеток протоков от остального материала. Если при анализе трахеальных клеток с помощью антител Trop two методом проточной цитометрии для флуоресцентной сортировки клеток (FACS) примерно через одну неделю культивирования в матригеле будут видны сферы, то люминальные сферы образуются из базальных клеток, а дистальные — из клеток протоков. Эффективность этого процесса составляет порядка 1–2%, при этом в матригеле все еще будут присутствовать одиночные клетки, которые, вероятно, представляют собой клетки протоков подслизистых желез, не обладающие способностью к самообновлению.

Базальные сферы имеют более крупный размер и люминарный вид. Инъекция стволовых клеток протоков в жировую подушку мыши приводит к образованию структур, напоминающих подслизистые железы, которые имеют сферическую форму и центральный просвет. Такие структуры видны в блоках даже без окрашивания гематоксилином и эозином.

Для получения среза, содержащего эти эпителиальные структуры, необходимо выполнить множество поперечных разрезов через жировую подушку. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изолировать популяцию стволовых клеток из клеток протоков слюнной железы; при должном навыке эта процедура занимает 10 часов. После выполнения данной процедуры условия культивирования могут быть изменены для поиска ответов на различные вопросы, касающиеся формирования сфер и факторов роста, стимулирующих регенерацию.