Генерация индуцированного регуляторных Т клеток из первичной человека наивного и Т-клеток памяти

Общая цель данной процедуры — получение регуляторных Т-клеток человека из первичных Т-клеток. Сначала из образцов крови человека выделяют мононуклеарные клетки периферической крови. Затем из смеси МНК очищают CD4-положительные Т-клетки и помещают их в культуру.

Через шесть дней клетки разделяют на наивные, memory-эффекторные и индуцированные регуляторные Т-клеточные субпопуляции с помощью проточного цитометра, после чего проводят супрессорные анализы. С помощью этих клеток демонстрируется, что данный метод позволяет получать человеческие регуляторные Т-клетки с супрессорной активностью. Основным преимуществом данной методики перед методами с использованием мышиных клеток является то, что наш метод для человека обладает большей физиологической и клинической значимостью, а также позволяет сравнивать Treg с другими популяциями клеток одного донора.

Устранение индивидуальной вариабельности субъектов. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы о регуляторных клетках, например, каковы регуляторные события, модулирующие переход от конвенциональных T-клеток к регуляторным, или какие сигнальные и транскрипционные события специфичны для регуляторных клеток? Значимость этой методики распространяется на терапию аутоиммунных заболеваний, воспалительных состояний и рака в связи с жизненно важной ролью, которую регуляторные клетки играют в иммунном гомеостазе.

Как правило, специалисты, впервые сталкивающиеся с данной технической задачей, испытывают трудности из-за разнообразия используемых методов, а на некоторых этапах — из-за узкого диапазона оптимальных условий для культивирования клеток. Хотя этот метод позволяет получить представление о развитии регуляторных Т-клеток, он также может быть использован для мониторинга пластичности дифференцировки Т-клеточных линий или для анализа способности Т-клеточного окружения индуцировать или предотвращать этот процесс. Процедуру развития регуляторных Т-клеток продемонстрируют Андреа МакКул и аспиранты Мари Катрин Ранье, Гэвин Эллис и Каталина Вале Ортега.

Начните выполнение данной процедуры с выделения мононуклеарных клеток периферической крови человека из 40–60 л лейкоцитарного слоя (buffy coat). Чтобы развести лейкоцитарный слой, перенесите его в стеклянную бутыль объемом 500 мл, подходящую для автоклавирования, содержащую 150 мл стерильного PBS. Затем добавьте стерильный PBS до достижения конечного объема 250 мл. Далее наполните десять 50-мл конических пробирок, налив в каждую по 20 мл раствора LymphoPrep.

Затем осторожно нанесите 25 миллилитров разведенного лейкоцитарного слоя поверх раствора Lympho prep, стараясь не перемешать его. Центрифугируйте пробирки в течение 30 минут при комнатной температуре при 500 ×g. Обязательно отключите торможение центрифуги, чтобы не нарушить целостность фракции лимфоцитов.

После центрифугирования PBM CS будет находиться на границе раздела между слоями лимфопрепарата и плазмы для их сбора. Аспирируйте плазму до тех пор, пока слой лейкоцитарного осадка (buffy coat), содержащий pbmc, не будет покрыт объемом примерно 1 ml. С помощью пипетки на 10 ml перенесите pbmc в новую пробирку объемом 50 ml.

После двукратного промывания клеток PBS ресуспендируйте их в 50 миллилитрах холодного RPMI и подсчитайте их количество с помощью гемоцитометра. Типичный выход составляет от 8×10⁸ до 1×10⁹ PBMC после определения концентрации. Ресуспендируйте PBMC до конечной концентрации 5×10⁷ на миллилитр в PBS, содержащем 2% FBS и 1 мM EDTA, затем перенесите клетки в новую 14-миллилитровую полипропиленовую пробирку с круглым дном.

Затем с помощью набора EA будет проведен негативный отбор интересующих клеток. Коктейли для обогащения Т-клетками, входящие в состав набора, содержат тетрамерный комплекс антител, который с одной стороны имеет антидекстриновые антитела, а с другой — антитела к нежелательным антигенам клеточной поверхности. При добавлении коктейля к клеткам тетрамерный комплекс антител связывает нежелательные клетки.

Затем добавляют магнитные частицы, покрытые декстраном, которые связываются с тетрамерным комплексом антител, соединяя ненужную клетку с магнитной частицей. Затем используют магнит для отделения ненужных клеток от целевых клеток, которые затем собирают для изоляции CD4-положительных T-лимфоцитов. Пипетируют от 1 × 10⁸ до 4,25 × 10⁸ PBMC в коническую пробирку объемом 15 мл. Затем добавляют по 50 мкл коктейля антител для обогащения человеческих CD4-положительных T-лимфоцитов на каждый миллилитр PBMC.

Перемешайте и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Перемешайте магнитные частицы, чтобы равномерно распределить их по всему раствору. Добавьте 100 µL магнитных частиц на каждый миллилитр pbmc.

Смешайте содержимое, осторожно пропипетировав два-три раза, а затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавьте PBS, содержащий FBS и EDTA, чтобы довести объем до 10 миллилитров на пробирку, и снова осторожно пропипетируйте два-три раза. Затем поместите открытую пробирку в магнитный сепаратор на пять минут, оставив пробирку в магните.

Перелейте жидкость в новую пробирку объемом 50 мл, чтобы изолировать интересующие клетки для более эффективного извлечения. Повторите этот процесс, добавив в пробирку дополнительный раствор P-B-S-F-B-S-E-D-T-A, перемешав его и снова поместив образец в магнит. После изоляции клеток подсчитайте их количество, затем центрифугируйте при 500 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре.

Ресуспендируйте осадок клеток в среде для поляризации до достижения концентрации 2 × 10⁶ клеток на мл. Затем приступайте к культивированию, как описано в следующем разделе видео, для индукции регуляторных Т-клеток. Предварительно прогрейте 6-луночные планшеты для культивирования тканей, покрытые анти-CD3, при 37 °C.

После прогрева планшетов аспирируйте PBS из лунок. Затем добавьте в каждую лунку по 4 мл суспензии обогащенных CD4+ клеток. Заполните все пустые лунки PBS для уменьшения испарения среды и инкубируйте в течение трех дней.

Центрифугируйте планшет в течение пяти минут при 500 ×g. Затем, не потревожив клетки на дне планшета, удалите половину среды и замените ее свежей средой, после чего инкубируйте еще от двух до трех дней. Теперь клетки можно сортировать с помощью метода флуоресцентной активации клеток (FACS), как описано в следующем разделе, или использовать в качестве целевых клеток для анализа супрессии, который описан далее; через два-три дня клетки и соответствующие контроли компенсации будут готовы к сортировке методом флуоресцентной активации. Для сортировки с целью разделения индуцированных регуляторных наивных и Т-клеток памяти окрасьте сортируемые клетки анти-CD25 PE, анти-CD45RA PE-Cy5 и анти-CD127 APC, как описано в сопроводительном документе.

Также обязательно добавьте антитела в соответствующие контроли компенсации для анализа методом FACS. После окрашивания ресуспендируйте клетки в промывочном буфере до концентрации 1 × 10⁷ клеток/мл, затем добавьте 1,5 мкл DNase I на 2 мл клеток и профильтруйте клетки через нейлоновый клеточный фильтр с размером пор 40 мкм. Перенесите клетки в полипропиленовые пробирки с круглым дном объемом 5 мл, при этом объем в каждой пробирке не должен превышать 3,5 мл.

Ресуспендируйте контрольные клетки для компенсации в 300 µL промывочного буфера. Настройте компенсацию на проточном цитометре, чтобы минимизировать перекрестное детектирование фильтрами PE A PC и PE sci-fi. Установите гейты для сортировки наивных Treg-клеток и Т-клеток памяти в полистирольные пробирки с круглым дном объемом 5 мл, содержащие 1 мл сыворотки новорожденного теленка, чтобы оценить, способны ли регуляторные Т-клетки, полученные в результате сортировки, подавлять пролиферацию Т-клеток.

Здесь проводится анализ супрессии. Несортированные обогащенные CD4-положительные клетки будут выполнять роль таргетных клеток. Они не должны содержать индуцированные CD25-положительные регуляторные Т-клетки.

Начните с маркировки целевых клеток CFSE с помощью набора для трассировки клеток согласно инструкциям производителя, используя 1 µL 5 M стокового раствора на 1 мл клеток вместо 2 µL. Затем осадите количество бусин для анализа супрессии Treg, равное общему количеству клеток, путем быстрого центрифугирования в микроцентрифужной пробирке. Промойте бусины один раз RPMI и снова осадите их после центрифугирования.

Отоспустите RPMI и повторно суспендируйте их до нужной концентрации в 8 µL среды для анализа супрессии на одну лунку 96-луночного круглодонного планшета для культивирования тканей. Добавьте 8 µL окрашенных CFSE таргетных клеток. Проверьте бусины и поляризованно отсортированные клетки до конечного объема свежей среды для анализа супрессии.

Среда объемом 200 µL. Все условия высевают в трех повторностях. Для подготовки контролей добавьте 100 µL клеток, окрашенных CFSE, 8 µL контрольных гранул (inspector beads) и 1 × 10⁵ свежих неокрашенных клеток в 92 µL среды для анализа супрессии.

Добавьте среду в каждую из первых двух контрольных лунок. Затем добавьте 100 µL клеток, окрашенных CFSE, и 1×10⁵ свежих неокрашенных клеток в 92 µL среды для анализа супрессии на лунку. Добавьте среду в каждую из двух следующих контрольных лунок.

Накройте планшет алюминиевой фольгой и поместите в инкубатор на пять дней в темноте. Соберите клетки из каждой лунки с помощью пипетирования и перенесите их в полистирольную пробирку с круглым дном объемом пять миллилитров. Центрифугируйте клетки при 500 ×g в течение пяти минут при температуре четыре °C.

Откачайте среду, затем повторно суспендируйте клетки в 300 µL холодного промывочного буфера с фоксацией. Для мониторинга процесса дифференцировки индуцированных регуляторных T-клеток очищенные первичные CD4-положительные CD25-отрицательные T-клетки человека культивировали в среде для iTreg; аликвоты, отобранные на 0, 1, 3 и 5 дни, анализировали методом проточной цитометрии для оценки экспрессии маркеров CD45RA, FoxP3, CTLA4 и CD25. Как видно на этих псевдоцветных точечных диаграммах, в течение пяти дней клетки пролиферируют и дифференцируются in vitro в ответ на кросс-линкинг CD3 в присутствии TGF-beta и IL-2, что в конечном итоге приводит к формированию профиля CD45RA-отрицательных, FoxP3-высоких, CTLA4-высоких и CD25-высоких клеток. Это свидетельствует о развитии индуцированных Treg из предшественников обычных T-клеток. Для оценки относительной способности полученных Treg подавлять пролиферацию T-клеток.

Клетки, меченные CFSE, культивировали с бусинами-инспекторами супрессии treg в присутствии сортированных наивных, memory- и iTreg-клеток, что видно на данной гистограмме. Клетки CD25 high, CD45RA negative CD127 negative. Low индуцированные регуляторные T-клетки являются единственным подмножеством после пятидневного культивирования, которое приобрело способность к регуляторной супрессии.

Это указывает на то, что клетки, полученные в данной системе, являются супрессорными регуляторными Т-клетками как фенотипически, так и функционально, а не активированными конвенциональными Т-клетками, которые могут временно экспрессировать FOX P3 и CD25, но не обладают иммуносупрессивным действием. Присутствие индуцированных регуляторных Т-клеток полностью подавляет пролиферацию CD4-положительных Т-клеток. Числа указывают на процент клеток, меченных CFSE, подвергшихся делению, чтобы подтвердить, что те же закономерности характерны и для очищенных субпопуляций Т-клеток.

Первичные наивные и Т-клетки памяти человека окрашивали CFSE и культивировали в среде для Treg. Через пять дней проводили фенотипирование клеток и оценивали скорость их деления, как показано далее. В данном случае Treg индуцировали из пула наивных Т-клеток и пула Т-клеток памяти после пяти дней культивирования.

В стандартной среде для культивирования регуляторных Т-клеток (IT reg medium) с использованием CFSE. Окрашивание исходных клеток показывает, что наивные или Т-клетки памяти дифференцируются в регуляторные Т-клетки только после нескольких раундов деления клеток; сравнительный анализ профилей окрашивания CFSE позволяет идентифицировать индуцированные регуляторные Т-клетки как наиболее пролиферирующие клетки в течение пяти дней культивирования. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как получить индуцированные Т-регуляторные клетки из популяции наивных, память-Т-клеток или общей популяции Т-клеток, полученных от одного донора при выполнении данной процедуры.

Важно соблюдать стерильность на протяжении всего процесса и не допускать воздействия света на CFSE после выполнения данной процедуры. Для получения ответов на другие вопросы, такие как различия в скорости деления клеток, синтезе специфических цитокинов и использовании ионных каналов между регуляторными и конвенциональными T-клетками, можно использовать другие методы, например, функциональные анализы. Разработка этого метода открыла исследователям в области иммунологии путь к изучению аутоиммунных заболеваний и других патологий, связанных с treg, у людей.

Не забывайте, что работа с человеческой кровью чрезвычайно опасна, поэтому при выполнении данной процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как надлежащее тестирование в банке крови и правильная утилизация отходов.