Идентификация и характеристика гликозилирования белков с использованием конкретных эндо-и exoglycosidases

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы проиллюстрировать использование гликозата для ферментативного дегликозилирования и анализа n- и O-сцепленного гликозилирования на модельном гликопротеине. Это достигается путем обработки гликопротеина PGA F или смесью для дегликозилирования белка. Кроме того, смесь для дегликозилирования белка была дополнена смесью дополнительных экзогликозилированных сахаров, которые иногда помогают удалить устойчивые к другим сахарам.

Мы проиллюстрируем этот метод с помощью модельного гликопротеинового рекомбинантного хорионического гонадотропина человека или ХГЧ бета на следующей странице SDS, за которым следует окрашивание в синий цвет Кумаси и метод сахарного окрашивания. Pro Q Emerald 300 используются для анализа гликозилированного D. Получены результаты анализа бета-белка ХГЧ, которые показывают, что бета ХГЧ гетерогенно гликозилирован и содержит несколько форм глико, что обусловлено различиями в миграции белков с обработкой гликозатом и без нее, а также снижением сигнала при окрашивании ProQ по мере их последовательного удаления.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как масс-спектрометрический анализ, заключается в том, что она проста, использует обычное лабораторное оборудование и хороша для начинающего гликобиолога. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области глико, например, является ли мой белок гликозилированным. Чтобы начать ферментативное дегликозилирование, разморозьте буферы, входящие в комплект для дегликозилирования белков.

Тщательно перемешайте трубочки и поддерживайте комнатную температуру. Поместите флаконы, содержащие фермент, на лед, растворите содержимое флакона с бета-ферментом ХГЧ в 600 микролитрах дистиллированной воды и держите на льду. После приготовления одного миллилитра одного буфера XG seven путем разбавления 10-кратного бульона в дистиллированной воде, используйте 25 микролитров для разбавления 0,5 микролитров PGA's f.

Приготовьте смесь экзогликозата, соединив два микролитра, каждый из четырех экзогликозаболеваний. Затем добавьте ХГЧ бета и 10 x буфер для денатурации гликопротеинов в семь пронумерованных пробирок для ПЦР, как указано в письменном протоколе, закройте пробирки и аккуратно перемешайте для денатурации белков в термоамплификаторе путем инкубации в течение 10 минут при температуре 94 градуса Цельсия, а затем удерживайте четыре градуса Цельсия После извлечения пробирок из центрифуги термоамплификатора для удаления видимой конденсации в каждой реакционной пробирке. Добавьте остальные реактивы согласно письменному протоколу. Закройте пробирки для ПЦР с помощью новых колпачков.

Затем перемешайте пробирки, аккуратно постукивая четыре раза после раскрутки содержимого, поместите пробирки в термоамплификатор и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов. Затем охладите образцы до четырех градусов Цельсия. Чтобы настроить страницу SDS, подготовьте новый буфер загрузки SDS в три раза.

С помощью DTT добавьте 12,5 микролитров из приготовленного трех восстанавливающих буфера загрузки SDS К каждому образцу закройте пробирки новыми крышками и аккуратно постучите по пробиркам для перемешивания. Инкубируйте пробирки в амплификаторе при температуре 94 градуса Цельсия в течение пяти минут, а затем охладите до четырех градусов Цельсия После инкубации 30 микролитров каждого образца и 10 микролитров белкового маркера На 10-20% геле триглицина. Сохраняем остаток каждого образца.

Электронетизируйте гель под напряжением 130 вольт до тех пор, пока D-передняя часть не окажется у нижней части геля. Когда гель закончит течь, снимите гель с гипса и поместите его в небольшую пластиковую коробку с достаточным количеством синего пятна кумаси, чтобы покрыть пятно от геля. Гель в течение одного часа с легким взбалтыванием После окрашивания геля.

Постирайте три раза по 30 минут. В 50 миллилитрах раствора задержите снимки с помощью транслюминатора белого света или сканера. Как вариант, гель можно высушить между листами целлофана.

В рамке запустите остаток от каждого образца и белковый маркер на 10-20% геле с содержанием триглицина, пока гель работает. Растворите изумрудный реагент ProQ с DMF и приготовьте растворы для фиксации, промывки и окисления от пятна, следуя инструкции по продукту, прилагаемой к набору. Когда электрофорез будет завершен, извлеките гель из гипса и поместите его в пластиковый ящик.

Закрепите гель, добавив 100 миллилитров приготовленного фиксированного раствора. Оставьте гель на ночь при комнатной температуре с легким перемешиванием на следующий день. Смойте гель 100 миллилитрами приготовленного раствора для умывания в течение 10 – 20 минут при комнатной температуре с легким помешиванием, повторив промывку второй раз свежим раствором для умывания.

Далее окислите углеводы путем инкубации геля с легким перемешиванием в течение 30 минут в 25 миллилитрах приготовленного окислительного раствора, после инкубации проведите две дополнительные промывки во время промывания геля. Приготовьте свежую морилку ProQ emerald 300, добавив 500 микролитров раствора реагента ProQ Emerald 300 в 25 миллилитров буфера для окрашивания, предоставленного в наборе. Окрашивайте гель путем инкубации в подготовленном пятне в темных условиях с легким перемешиванием в течение 90-120 минут после окрашивания гелем.

Повторите два шага стирки, как описано ранее. Затем запишите изображения с помощью УФ-транс-осветителя с яркостью 300 нанометров. В качестве заключительного шага сравните изображения окрашенного геля кумаси с гелем для изумрудного окрашивания ProQ.

Изменения в миграции белков после ферментативного дегликозилирования можно увидеть, если сравнить контрольный образец с обработкой F PGA. Для удаления n гликанов и обработки смесью дегликозилирования для удаления n и O гликанов дальнейшее уменьшение размера после расщепления с дополнительным гликосатом не наблюдается. Помимо изменения массы, полосы становятся более четкими по мере удаления гликанов.

Полоса, проходящая под маркером в 17 килодальтон, вероятно, представляет собой полностью дегликозилированный бета-полипептид ХГЧ. Полосы с пятой по седьмую показывают полосы, соответствующие глико. Другие полосы могут быть получены в результате неполного дегликозилирования или из нескольких неидентифицированных белков, присутствующих в образце бета-ХГЧ.

Изумрудно-зеленый реагент окисляет и окрашивает все гликаны, присутствующие в молекуле белка. Таким образом, интенсивность сигнала уменьшается по мере ферментативного d-гликозилирования бета-ХГЧ. Остаточный сигнал на третьей и четвертой дорожках указывает на наличие гликановых мотивов, устойчивых к используемым ферментам.

Дополнительный гликозат используется на четвертой дорожке. Удалите несколько лишних остатков сахара. Миграция белка такая же, но можно заметить небольшое снижение интенсивности окрашивания.

Резистентные сахарные фрагменты присутствовали не у всех видов белка. Некоторые полосы не были обнаружены изумрудно-зеленым цветом, что указывает на то, что они были сильно дегликозилированы. Дополнительные данные подтверждают вывод о том, что бета ХГЧ гетерогенно гликозилирован. Нижняя полоса на второй полосе тусклая на изумрудно-зеленом изображении.

В то время как верхняя полоса на второй полосе ярко выражена, что указывает на то, что многие группы GLYCAN все еще присутствуют, эти данные подтверждают вывод о том, что рекомбинантный бета ХГЧ, экспрессируемый в клетках мыши, содержит множественные гликоформы из-за присущей гликозилированию гетерогенности. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как масс-спектрометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как: каков уровень заполненности? Какова степень гликозилирования или какова тонкая структура гликанов?

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать гликозилат для ферментативного дегликозилирования и анализа NNO-связанных гликанов. О гликопротеинах. Выбор способа детектирования может быть затруднен, потому что области окрашивания белков полезны только в том случае, если дегликозилирование приводит к значительному сдвигу молекулярной массы других белков.

Мы наблюдали аномальные миграции после дегликозилирования и обнаружили, что любое изменение миграции является доказательством того, что белок был дегликозилирован.