Идентификация и характеристика гликозилирования белков с использованием конкретных эндо-и exoglycosidases

Общая цель следующего эксперимента — продемонстрировать использование glycosate для ферментативного дегликозилирования и анализа N- и O-связанного гликозилирования модельного гликопротеина. Это достигается путем обработки гликопротеина PGA's F или смесью для дегликозилирования белков. Кроме того, смесь для дегликозилирования белков была дополнена смесью дополнительных экзогликозидаз, которые иногда помогают удалить устойчивые сахарные остатки.

Мы демонстрируем этот метод на примере модельного гликопротеина — рекомбинантного бета-субъединицы хорионического гонадотропина человека (HCG beta). Далее следует электрофорез в ПААГ с SDS, окрашивание кумаси синим и метод специфического окрашивания сахаров Pro Q Emerald 300 для анализа гликозилирования. Результаты анализа образцов HCG beta показывают, что HCG beta гликозилирован гетерогенно и содержит несколько гликоформ, что подтверждается различиями в миграции белков с обработкой гликозидазой и без нее, а также ослаблением сигнала при окрашивании Pro Q по мере последовательного удаления гликанов.

Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как масс-спектрометрический анализ, является его простота, использование стандартного лабораторного оборудования и доступность для начинающих специалистов в области гликобиологии. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в этой области, например, гликозилирован ли изучаемый белок. Для начала ферментативного дегликозилирования разморозьте буферы, входящие в состав набора для дегликозилирования белков.

Тщательно перемешайте содержимое пробирок и выдержите при комнатной температуре. Поместите флаконы с ферментом на лед, растворите содержимое флакона с HCG beta в 600 µL дистиллированной воды и храните на льду. Приготовив 1 мл 1X буфера G7 путем разведения 10X стокового раствора в дистиллированной воде, используйте 25 µL этого буфера для разведения 0,5 µL PGA's f.

Подготовьте смесь экзогликозидаз, объединив по два микролитра каждой из четырех экзогликозидаз. Затем добавьте HCG beta и 10-кратный денатурирующий буфер для гликопротеинов в семь пронумерованных ПЦР-пробирок, как указано в письменном протоколе; закройте пробирки крышками и аккуратно перемешайте. Денатурируйте белки в термоциклере, инкубируя их в течение 10 минут при 94 °C, после чего установите режим Hold при 4 °C. Извлеките пробирки из термоциклера и центрифугируйте их, чтобы удалить видимый конденсат. В каждую реакционную пробирку добавьте остальные реагенты согласно письменному протоколу. Закройте ПЦР-пробирки новыми крышками.

Затем перемешайте содержимое пробирок, осторожно постучав по ним четыре раза после центрифугирования, поместите пробирки в термоциклер и инкубируйте при 37 °C в течение четырех часов. После этого охладите образцы до 4 °C. Для проведения SDS-PAGE приготовьте свежий 3x восстанавливающий буфер для нанесения образцов SDS.

Добавьте 12,5 мкл приготовленного трехкратного восстанавливающего буфера для нанесения SDS к каждому образцу с DTT, закройте пробирки новыми крышками и осторожно постучите по ним для перемешивания. Инкубируйте пробирки в термоциклере при 94 °C в течение пяти минут, а затем охладите до 4 °C. После инкубации нанесите 30 мкл каждого образца и 10 мкл маркера белков на 10–20% трис-глициновый гель. Остатки каждого образца сохраните.

Проводите электрофорез геля при напряжении 130 вольт до тех пор, пока фронт красителя не достигнет нижней части геля. По завершении электрофореза извлеките гель из формы и поместите его в небольшой пластиковый контейнер с достаточным количеством красителя кумасси синий, чтобы полностью покрыть гель. Окрашивайте гель в течение одного часа при осторожном перемешивании. После завершения окрашивания извлеките гель.

Промойте трижды по 30 минут. В 50 миллилитрах раствора для дестайнинга зарегистрируйте изображения с помощью транслюминатора с белым светом или сканера. В качестве альтернативы гель можно высушить между листами целлофана.

В одном кадре проведите электрофорез остатков каждого образца и маркера белков на 10–20% трицин-глициновом геле. Пока идет разделение, растворите реагент ProQ emerald в DMF и приготовьте основные растворы для фиксации, промывки и окисления, необходимые для окрашивания, согласно инструкции к набору. По завершении электрофореза извлеките гель из формы и поместите его в пластиковый контейнер.

Зафиксируйте гель, добавив 100 миллилитров подготовленного фиксирующего раствора. Оставьте гель на ночь при комнатной температуре с осторожным перемешиванием на следующий день. Промойте гель 100 миллилитрами подготовленного промывочного раствора в течение 10–20 минут при комнатной температуре с осторожным перемешиванием, повторив промывку второй раз со свежим промывочным раствором.

Затем окислите углеводы, инкубируя гель при осторожном перемешивании в течение 30 минут в 25 миллилитрах приготовленного окисляющего раствора; после инкубации проведите две дополнительные промывки геля. Приготовьте свежий краситель ProQ emerald 300, добавив 500 микролитров раствора реагента ProQ Emerald 300 к 25 миллилитрам буфера для окрашивания, входящего в состав набора. Окрасьте гель, инкубируя его в приготовленном красителе в темноте при осторожном перемешивании от 90 до 120 минут.

Повторите два этапа промывки, описанных ранее. Затем зарегистрируйте изображения с помощью УФ-транслюминатора при 300 нанометрах. В качестве заключительного этапа сравните изображения геля, окрашенного кумаси, с изображениями геля, окрашенного ProQ emerald.

Изменения в миграции белков после ферментативного дегликозилирования можно наблюдать при сравнении контрольного образца с образцом, подвергнутым обработке PGA's F. После удаления N-гликанов и применения смеси для дегликозилирования для удаления N- и O-гликанов дальнейшего уменьшения размера при последующем переваривании дополнительной гликозатой не наблюдается. Помимо изменения массы, полосы становятся более четкими по мере удаления гликанов.

Полоса, расположенная ниже маркера 17 килодальтон, вероятно, соответствует полностью дегликозилированному бета-полипептиду ХГЧ. Дорожки с пятой по седьмую демонстрируют полосы, соответствующие гликоформам. Другие полосы могут быть результатом неполного дегликозилирования или присутствия в образце бета-субъединицы ХГЧ нескольких неопознанных белков.

Реагент «изумрудно-зеленый» окисляет и окрашивает все гликаны, присутствующие в молекуле белка. Таким образом, интенсивность сигнала снижается по мере ферментативного дегликозилирования HCG бета. Остаточный сигнал в дорожках три и четыре указывает на наличие гликановых мотивов, устойчивых к используемым ферментам.

Дополнительный гликозилат используется в четвертой дорожке. Удалите несколько лишних остатков сахара. Миграция белка остается прежней, однако наблюдается небольшое снижение интенсивности окрашивания.

Устойчивые сахарные остатки присутствовали не во всех видах белков. Некоторые полосы не были обнаружены красителем Emerald Green, что указывает на их глубокое дегликозилирование. Дополнительные данные подтверждают вывод о том, что ХГЧ-бета гетерогенно гликозилирован. Нижняя полоса в дорожке 2 слабо видна на изображении с Emerald Green.

Хотя верхняя полоса на второй дорожке яркая, что указывает на сохранение множества групп GLYCAN, эти данные подтверждают вывод о том, что рекомбинантный HCG бета, экспрессированный в клетках мыши, содержит несколько гликоформ из-за присущей гликозилированию гетерогенности. После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как масс-спектрометрия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например: какова степень заполнения? Какова степень гликозилирования или какова тонкая структура гликанов?

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как использовать glycosylate для ферментативного дегликозилирования и анализа N-связанных гликанов на гликопротеинах. Выбор метода детекции может быть затруднен, поскольку окрашивание белков эффективно только в тех случаях, когда дегликозилирование приводит к значительному сдвигу молекулярной массы других белков.

Мы наблюдали аномальную миграцию после дегликозилирования и установили, что любое изменение миграции свидетельствует о том, что белок был дегликозилирован.