Хроматина анализ взаимодействия с парными-End тегов секвенирования (Chia-ПЭТ) для карт хроматина Взаимодействие и понимание регуляции транскрипции

Анализ взаимодействий COMIN с использованием секвенирования порошков и тегов представляет собой метод общегеномного анализа дальних взаимодействий COMIN. Вкратце, мы называем этот метод magic share pad. Данный метод включает множество этапов молекулярно-биологических манипуляций и может быть сложным в исполнении.

Таким образом, в следующем видеоролике мы продемонстрируем некоторые из ключевых этапов иммунопреципитации и конструирования библиотеки для анализа ChIA-PET. Иммунопреципитация хроматина, известная как ChIP, является первым критическим этапом создания библиотеки ChIA-PET. На этом этапе образцы хроматина из клеточных культур подвергаются сшивке, соникации и иммунопреципитации.

Затем отдельные аликвоты ДНК чипа лигируют с баркодированными полулинкерами и проводят проксимальную лигацию. ПЭТы (pets) высвобождают путем рестрикции, очищают на покрытых магнитных бусинах и лигируют с адаптерами для секвенирования следующего поколения. Химерные стул-ПЭТы (chair pets) идентифицируют по составу линкеров AB и фланкирующим тегам.

Центральные последовательности линкеров считываются и картируются по геному. В данном видео мы продемонстрируем стандартный протокол ChIP, который регулярно используется в нашей лаборатории на линии клеток рака молочной железы MCF 7. Согласно нашим данным, более высокая эффективность обогащения при ChIP с использованием специфических антител обеспечивает лучшее качество данных ChIA-PET. Поэтому мы настоятельно рекомендуем оптимизировать протокол ChIP и подтвердить эффективность обогащения с помощью количественной ПЦР (qPCR).

Перед тем как приступить к конструированию библиотеки ChIP-seq, клетки CF7 культивируют в чашке для культивирования тканей объемом 500 см² до достижения примерно 75% конфлюэнтности, что соответствует примерно 20 миллионам клеток перед сшивкой. Удаляют ростовую среду и дважды промывают клетки теплым PBS. Фиксируют клетки свежеприготовленным 1,5 мМ раствором EGS в течение 45 минут на ротаторе при комнатной температуре. Затем добавляют формальдегид до конечной концентрации 1% и инкубируют в течение 20 минут.

Эффективность сшивания имеет критическое значение и варьируется в зависимости от клеточных линий и исследуемого белка. Необходимо оптимизировать концентрацию сшивающего агента, время и температуру инкубации. Погасите действие сшивающих агентов, добавив глицин до конечной концентрации 200 millimolar, и выдержите в течение 10 Minutes.

Удалите погашенные кросс-линкеры и дважды промойте клетки холодным PBS. Соберите клетки путем соскоба осадка с помощью настольной центрифуги с охлаждением. Осадок теперь готов к лизису клеток. В качестве альтернативы заморозьте осадок при температуре -80 °C. Если осадок клеток был заморожен, разморозьте его на льду перед тем, как приступить к лизису клеток, ресуспендировав осадок в лизис-буфере с 0,1% SDS.

Центрифугируйте пробирку при 4 °C в охлаждаемой центрифуге, удалите супернатант и повторите лизис клеток. После этого проведите лизис ядер для высвобождения сшитого хроматина перед его фрагментацией. Отсутствие ядерной мембраны позволяет подвергать сшитый хроматин соникации в более мягких условиях.

Ресуспендируйте ядерный осадок в 1% SDS лизис-буфере. Перенесите суспензию в центрифужную пробирку для высокоскоростного центрифугирования. Центрифугируйте пробирку при температуре 4 °C.

Удалите ядерный дебрис путем центрифугирования. Хроматиновый осадок должен выглядеть следующим образом. С помощью наконечника дозатора P 1000 разбейте осадок на части и дважды промойте буфером для лизиса 0.1%SDS.

Центрифугируйте пробирку с пеллетом при 4 °C в охлаждаемой центрифуге. Теперь ядерный пеллет готов к соникации. В качестве альтернативы пеллет можно заморозить при -80 °C.

Перенесите пеллет в прозрачную пробирку. Добавьте к пеллету лизирующий буфер с 0,1% SDS и удалите все пузырьки воздуха. В течение всего процесса соникации держите образцы охлажденными, чтобы предотвратить перегрев. На эффективность соникации могут влиять такие различные условия, как объем буфера, глубина погружения зонда, мощность соникации, количество циклов и степень кросс-линкинга.

Проведите обратную сшивку и аликвотирование хроматина с использованием протеиназы K, после чего проведите электрофорез в агарозном геле. Для проверки эффективности фрагментации рекомендуется провести оптимизацию, чтобы получить желаемый диапазон размеров ДНК от 200 до 600 п. н. Удалите клеточный дебрис путем центрифугирования.

Теперь хроматин готов к предварительной очистке с помощью магнитных бусин. В качестве альтернативы процесс можно остановить при температуре -80 °C до сбора достаточного количества хроматина. Для начала процедуры ChIP промойте бусины трижды буфером для промывки бусин; данная и все последующие промывки с использованием магнитных белковых бусин состоят из следующих этапов.

Добавьте соницированный хроматин к предварительно промытым бусинам и инкубируйте в отдельной пробирке в течение ночи при температуре 4 °C. Покройте предварительно промытые бусины антителами и инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C. Промойте бусины, покрытые антителами, дважды буфером для промывки бусин.

Высокая сложность субстрата для лигации при сближении неизбежно приводит к значительному уровню неспецифического шума, что увеличивает стоимость секвенирования. Помимо снижения уровня сложности и фонового шума, мы использовали моноклональное антитело к РНК-полимеразе II мыши для идентификации взаимодействий хроматина, участвующих в регуляции транскрипции.

Это позволяет исследовать активные промоторы и соответствующие им регуляторные области, что дает возможность понять механизмы эффективной и, возможно, кооперативной транскрипции. Удалите промывочный буфер из бусин, покрытых антителами; объедините предварительно очищенный хроматин с бусинами, покрытыми антителами, и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После ночной инкубации бусины подвергают серии промывок для удаления несвязавшегося хроматина, затем бусины ресуспендируют в TE-буфере. Отберите небольшую аликвоту для количественной проверки обогащения. Анализ взаимодействий хроматина с использованием секвенирования PaD-tag — это метод, разработанный для крупномасштабного анализа de novo взаимодействующих структур хроматина высшего порядка.

Фрагменты ДНК, обогащенные в результате иммунопреципитации хроматина, фиксируются путем лигирования по близости. Стратегия с использованием «пад-» и «тэг-» последовательностей применяется при конструировании библиотек CHI PET, которые затем секвенируются с помощью высокопроизводительных технологий секвенирования следующего поколения. В данном видео мы продемонстрируем критически важные экспериментальные аспекты конструирования библиотек CHI PET.

Первая половина процесса создания библиотеки включает манипуляции с частицами белка A или G, к которым связаны фрагменты ДНК, для удаления ферментов и буферной соли. После каждой ферментативной реакции на каждом этапе промывки используйте осторожное центрифугирование и легкое встряхивание. Несколько раз пропипетируйте супернатант, чтобы максимально эффективно собрать частицы при помещении их на магнитный сепаратор.

Концентратор для всех этапов инкубации, содержащих частицы в реакционной смеси. Заранее приготовьте мастер-микс и добавьте фермент в последнюю очередь после того, как частицы будут гомогенно ресуспендированы. Убедитесь, что частицы тщательно перемешиваются на протяжении всей инкубации. Олигонуклеотиды половины линкеров сконструированы с внутренним штрихкодом, состоящим из четырех нуклеотидов, и сайтом распознавания для рестриктазы II S MME I.

После лигирования полулинкеров к привязанным фрагментам ДНК в C-хроматиновых комплексах взаимодействующие фрагменты ДНК будут соединены полной последовательностью линкера. Эти полулинкеры создают последовательности с гетеродимерными ab-линкерами, образующимися в результате неспецифического лигирования, или последовательности с гомодимерными AA- или BB-линкерами, образующимися в результате специфического лигирования. Таким образом, использование двух полулинкеров с разными нуклеотидными штрихкодами позволяет дифференцировать различные эксперименты или повторности, а также контролировать частоту неспецифического химерного лигирования между различными комплексами на чипе.

Важно подготовить реакционную смесь на льду и осторожно разморозить полулинкеры на льду. Тщательно смешайте полулинкеры с водой, а затем с PEG, содержащим лигазный буфер. Перед использованием убедитесь, что мастер-микс тщательно перемешан.

Добавьте Т4 ДНК-лигазу к суспензии ДНК чипа только после того, как полулинкеры и фрагменты ДНК чипа будут тщательно перемешаны, чтобы предотвратить конкатенацию полулинкеров. Герметично закройте пробирку парафильмом. Инкубируйте в течение ночи при 16 °C с перемешиванием. Затем неповрежденные хроматиновые комплексы элюируют с бусин путем добавления SDS; используйте буфер EB для элюции ДНК, чтобы снизить концентрацию SDS, и Triton X 100 для нейтрализации SDS. Циркуляризация хроматиновых комплексов облегчается за счет лигирования двух полулинкеров, что создает полную последовательность линкера в месте взаимодействия. Проведите лигирование элюированных хроматиновых комплексов в условиях экстремального разведения, чтобы минимизировать лигирование между различными ДНК-белковыми комплексами; добавляйте Т4 ДНК-лигазу только после того, как элюированные хроматиновые комплексы будут хорошо разбавлены в реакционной смеси. После обратного сшивания для удаления связанных с ДНК белков очистите циркуляризованные фрагменты ДНК с помощью фенол-хлороформной экстракции. Для удобного разделения используйте систему KaiGen phase lock gel.

После экстракции фенолом используйте carrier DNA GlycoBlue A для увеличения массы и видимости осадка. Олигонуклеотиды линкеров содержат фланкирующие сайты узнавания MmeI. Рестриктаза II типа MmeI делает разрезы на 18-м и 20-м нуклеотидах ниже своих сайтов связывания, создавая короткие метки фрагмента хроматина, что приводит к образованию конструкций «метка PET — линкерная метка» (сокращенно PETs).

Кроме того, каждая половина линкера модифицирована биотином для обеспечения очистки конструктов pet с помощью магнитных частиц, покрытых стрептавидином. Проведите однократное переваривание MME для высвобождения конструктов тега-линкера. Очистите pet путем селективного связывания с частицами стрептавидина, затем лигируйте конструкты pet с адаптерами для высокопроизводительного секвенирования.

Используйте ДНК-полимеразу Fusion для амплификации продукта лигирования библиотеки CHI PET. ДНК-полимераза применяется для получения матриц с высокой точностью и эффективностью. Подготовьте ПЦР-смесь на льду и добавляйте ДНК-полимеразу Fusion в последнюю очередь.

Поскольку фермент проявляет 3'→5'-экзонуклеазную активность, которая может привести к деградации праймеров в отсутствие dNTPs. Если библиотека Charpet сконструирована успешно, должна появиться выраженная, четко определенная полоса размером примерно 223 п.н. При вырезании полосы 223 п.н. из геля избегайте попадания неспецифических полос, а затем очистите вырезанную полосу с помощью протокола Gel Crush.

Перед проведением высокопроизводительного секвенирования выполните контроль качества с помощью биоанализатора Agilent 2100 с использованием набора DNA 1000. Мы только что продемонстрировали процедуру CHI PET для несмещенного детектирования взаимодействий хроматина в масштабе всего генома. Качество данных CHI PET зависит от эффективности используемого чипового антитела и глубины секвенирования.

Для картирования взаимодействий мы используем от 18 до 20 миллионов ридов. Данный протокол был успешно применен для характеристики сетей взаимодействий хроматина, связываемых рецептором эстрогена и РНК-полимеразой в геноме человека. Мы полагаем, что этот метод станет мощным инструментом для будущих исследований трехмерной архитектуры биологии транскрипции в контексте всего генома.

Надеемся, что это видео будет вам полезно. Спасибо за просмотр.I.