Заражение эмбрионов данио рерио с внутриклеточные бактериальные патогены

Общая цель этой процедуры заключается в микроинъекции эмбрионов рыбок данио с флуоресцентными бактериями для визуализации взаимодействия с иммунными клетками хозяина в реальном времени. Это достигается путем предварительной подготовки и загрузки инъекционной иглы бактериальными суспензиями. Затем эмбрионы помещаются в стадию и выравниваются на инъекционной пластине.

Затем бактериальный инокулюм вводится путем для достижения либо местной, либо системной бактериальной инфекции. Наконец, эмбрионы монтируются и визуализируются эмбрионы. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают внутриклеточную локализацию бактериальных патогенов внутри флуоресцентных фагоцитов прозрачного эмбрионального хозяина данио-рерио с помощью флуоресценции и конфокальной микроскопии.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, потому что модель эмбриона рыбки данио очень мощна для визуализации взаимодействия патогенов хозяина в жизни. После вытягивания стеклянных микрокапиллярных игл и скоса кончиков под углом 45 градусов поместите эмбрионы рыбок данио через 28 часов после оплодотворения, проверив постоянное кровообращение. Начало пигментации в глазу, прямой хвост и сердце, расположенное вентрально к глазу.

После того, как эмбрионы будут обезболены, используйте наконечник микрозагрузчика, чтобы загрузить иглу заранее подготовленным бактериальным инокулянтом. Установите заряженную иглу на микроманипулятор, подключенный к стойке, и расположите его под стереомикроскопом. Установите время впрыска на 0,2 секунды и компенсационное давление на 15 Гектор Паскалей.

Отрегулируйте давление впрыска в диапазоне от 700 до 900 Гектора Паскалей, чтобы получить правильный объем инъекции для используемой иглы. Перед введением установите микроманипулятор с заряженной иглой в правильное положение. Поместите обезболенные эмбрионы на плоскую пластину для инъекций с 1%-ной агарозой и удалите излишки воды из яиц.

Затем используйте инструмент для петли для волос, чтобы выровнять эмбрионы для каждой инъекции. Перемещайте пластину вручную во время инъекций, чтобы ориентировать эмбрионы так, чтобы их хвосты были направлены к кончику иглы. Поместите кончик иглы непосредственно над зубчатой веной рядом с урогенитальным отверстием.

Проткните перидерму кончиком иглы и введите желаемую дозу флуоресцентно меченных бактерий. Мы используем около 250 колониеобразующих единиц или КОЕ сальмонеллы typhimurium и около 120 КОЕ mycobacterium marum. Введенная бактериальная суспензия будет следовать за кровотоком через кожуховую вену к кардиомонитору, если инъекция была выполнена правильно, путем проверки расширения объема сосудистой системы сразу после пульса.

Часто проверяйте, чтобы объем инъекции оставался неизменным во время эксперимента. Чтобы обеспечить контроль за консистенцией инъекций на протяжении всего эксперимента, введите каплю бактерий непосредственно в каплю стерильного PBS на бактериальной питательной среде. Примерно после каждой 30-й инъекции эмбриона выкладывайте эту каплю и подсчитывайте колонии бактерий после инкубации.

Чтобы определить КОЕ в объеме инъекции, используйте флуоресцентный стереомикроскоп для наблюдения за отдельными флуоресцентными клетками штирии, циркулирующими в кровотоке непосредственно после инъекции, и отбраковывайте эмбрионы, которые не были введены должным образом. Флуоресцентные агрегаты бактерий M. marum должны быть заметны через два дня после заражения и со временем увеличиваться в размерах. Чтобы ввести в проток кювье, выстройтесь под наркозом через два-три дня после оплодотворения эмбрионов.

Что касается инъекции в вену няньки под углом 45 градусов от дорсальной стороны эмбриона, введите иглу в начальную точку протока кювье. Только дорсально к месту, где проток начинает расширяться над желточным мешком для инъекции заднего желудочка мозга. Обезболите эмбрионы через 32 часа после оплодотворения их тыльной стороной к кончику иглы.

Введите иглу в задний желудочек мозга из переднего положения, не касаясь нейрогелия, чтобы ввести его в хвостовые мышцы. Поместите эмбрионы под наркоз через один-два дня после оплодотворения так, чтобы их хвост был направлен к кончику иглы, и с углом иглы примерно 65 градусов, введите их в мышцу над мочеполовым отверстием для введения глазных пузырьков. Ориентируйте обезболивание через два-три дня после оплодотворения эмбрионов так, чтобы хвостики были направлены в сторону иглы.

Вводите под углом 65 градусов и при низком давлении для инъекции в узелковый канатик в течение одного-двух дней. После оплодотворения эмбрионы с хвостом, направленным в сторону от иглы. Введите иглу через мышечную ткань хвоста в спинной мозг.

Для инъекции желтка от 16 до 1000 эмбрионов на клеточной стадии прокалывают иглу через корион в центр желтка, чтобы визуализировать инфекцию. Обезболивайте инфицированные эмбрионы в 1%-ной слоеной чашке Петри, покрытой яичной водой, содержащей трику. С помощью инструмента для петли для волос выровняйте эмбрионы в правильном положении для визуализации под флуоресцентным стереомикроскопом.

Можно наблюдать циркуляцию отдельных флуоресцентных клеток S tym в кровотоке сразу после инъекции. Если требуется положение, отличное от бокового обзора. Поместите эмбрионы в 1,5% метилцеллюлозу и используйте инструмент для волосяной петли, чтобы манипулировать эмбрионом в нужном положении, чтобы визуализировать инфекцию с помощью инвертированного конфокального микроскопа.

Положите каплю аэроса с низкой температурой плавления на тарелку со стеклянным дном. Поместите обезболенный эмбрион в аэрокаплю с ограниченным количеством яичной воды и используйте инструмент для петли для волос, чтобы манипулировать эмбрионом в нужном положении. Дайте аэро застыть и погрузите аэрокаплю в яичную воду, содержащую трику.

Теперь образец готов к конфокальной визуализационной инъекции бактерий salmonella typhimurium или Mycobacterium marum в кровяной остров эмбрионов в течение одного дня. Постоплодотворение приводит к быстрому фагоцитозу путем распространения макрофагами относительно крупных и ярко флуоресцентных DS. Штирийские бактерии с красной меткой могут быть визуализированы непосредственно с помощью стереофлуоресценции и конфокальной визуализации в течение двух часов. Постинфекция показывает, что многие бактерии фагоцитозно фуресцируют флуоресцентными макрофагами.

Инъекционная доза 250 КОЕ дикого типа штирии вызовет сильную провоспалительную реакцию и приведет к летальному исходу в течение суток. Напротив, внутривенное введение эрума приводит к персистирующей инфекции, при которой инфицированные макрофаги образуют плотные агрегаты, которые рассматриваются как начальные стадии гранулем, которые являются отличительным признаком туберкулеза. Конфокальная визуализация такого гранулемоподобного агрегата в трансгенной линии EG one EGFP через пять дней после заражения показывает внутриклеточный рост меченых M num бактерий с вишней.

Внутри зеленых флуоресцентных макрофагов бактерии могут быть введены в задний желудочек мозга, который представляет собой компартмент, лишенный макрофагов, через 32 часа после оплодотворения инъекция от 20 до 100 М меченых вишневых бактерий M. marum в этот компартмент приводит к быстрой инфильтрации макрофагов, которые фагоцитируют бактерии, как показано здесь. Использование трансгенного M-P-X-E-G-F-P введения примерно 20 КОЕ Штирии в отический везикулу приводит к привлечению нейтрофилов через три часа после инфицирования. Хотя эта реакция не наблюдается при контрольных инъекциях PBS, хорда, которая, по-видимому, устойчива к инфильтрации лейкоцитами, является разрешительным компартментом для роста мутантов эрума, которые сильно ослабляются при введении в другие ткани.

После введения дозы 2240 КОЕ бактерии распространяются в течение нескольких дней в эмбриональные ткани и образуют гранулемы, похожие на агрегаты. Аналогично тем, которые наблюдаются при обычном методе внутривенного введения. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что правильное определение стадии эмбрионов рыбок данио имеет решающее значение, потому что иммунная система эмбриона становится все более компетентной во время развития.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как профилирование транскриптома и иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как врожденная иммунная система эмбриона реагирует на патогенные инфекции.