Выделение растворимых и нерастворимых олигомеров PrP в нормальном мозга человека

Целью данной процедуры является выделение растворимого и нерастворимого прионного белка или PRP из всех связок нормального человеческого мозга. Это достигается путем предварительной гомогенизации ткани человеческого мозга и выделения фракций. Затем проводится скоростное центрифугирование в ступенчатом градиенте сахарозы.

Затем проводится эксклюзионная хроматография. На заключительном этапе PRP захватывают с помощью белка G5P. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие выделение растворимых и нерастворимых PRP или агрегатов из нормального мозга человека с помощью ультрацентрифугирования в ступенчатых градиентах сахарозы, эксклюзионной хроматографии и захвата PRP с помощью G5P. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы при исследовании прионных заболеваний, включая болезнь Крейтцфельта — Якоба, болезнь губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота и клинические изнуряющие заболевания. Кроме того, он может дать представление о выделении растворимых и нерастворимых белковых агрегатов не только при прионных заболеваниях, но и при других патологиях, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данные методы, могут столкнуться с трудностями, так как все этапы эксперимента являются важными и требуют особой осторожности. Видеодемонстрация этих процессов имеет решающее значение, поскольку этапы SEC Fi и захвата PRP с помощью G five P сложно описать словами, и их корректное выполнение возможно только при максимально точном соблюдении техники операций. Для приготовления гомогената мозга сначала добавьте 100 µL лизирующего буфера к 100 mg замороженной ткани мозга; используя моторизованный пестик, гомогенизируйте ткань на льду, заморозьте её на сухом льду в течение пяти минут, а затем гомогенизируйте повторно.

Приготовьте 20% или 10% общий гомогенат мозга, добавив 300 или 800 мкл соответственно лизирующего буфера. Используя настольную центрифугу, центрифугируйте гомогенат при 1000 G в течение 10 минут при температуре 4 °C. Соберите SNA в центрифуге с ротором SW 55, центрифугируя фракцию S1 при 35 000 об/мин в течение одного часа при температуре 4 °C.

Перенесите супернатант в чистую пробирку. Ресуспендируйте нерастворимый в детергенте осадок в лизис-буфере для подготовки образцов для вестерн-блоттинга. Инкубируйте фракции S2 и P2 с протеиназой К в концентрации 50 µg/mL в течение одного часа при 37 °C.

Прекратите переваривание, добавив 5 mM PMSF и буфер для образцов с SDS. Прокипятите образцы в течение 10 минут, затем охладите их при комнатной температуре в течение пяти минут. Для проведения седиментационного анализа по скорости начните с инкубации 450 µL фракции 20%S с равным объемом 2% Sarco X в воде на льду в течение 30 минут в центрифужных пробирках объемом 5 mL. Добавьте по 0,5 mL сахарозы концентрацией 60%, 30%, 25%, 20%, 15% и 10%; нанесите 0,4 mL инкубированной фракции S one на поверхность градиента сахарозы 10–60%.

Центрифугируйте градиент ступенчатого осаждения в роторе SW 55 при 48 000 об/мин в течение одного часа при температуре четыре градуса Цельсия, начиная с верхней части пробирки. Соберите 12 равных фракций объемом по 283 µL каждая. Возьмите по 20 µL из каждой фракции и добавьте равный объем буфера для образцов с SDS.

Для подготовки образцов для SDS-ПАГЭ прокипятите образцы в течение 10 минут, затем охлаждайте их в течение четырех минут. Центрифугируйте образцы при 1000 G в течение одной минуты.

Затем перемешайте их на вортексе перед нанесением на готовый гель для эксклюзионной хроматографии. Эксклюзионная хроматография используется для определения олигомерного состояния молекул PRP. Начните с нанесения образцов семи индивидуальных маркеров молекулярной массы объемом 200 µL на колонку 1 × 30, заполненную сорбентом Superdex 200 HR.

Используйте объем элюции синего декстрана в качестве мертвого объема. Рассчитайте пиковые объемы элюции VE на основе хроматограммы и фракционного удерживания. Рассчитайте коэффициент распределения KAV по формуле KAV равно V минус V zero делить на VT минус V zero.

Для построения калибровочной кривой постройте график зависимости KAV белковых стандартов от логарифма их молекулярной массы. Затем нанесите 200 µL образца S one на колонку при скорости потока 0,25 mL/min.

Промойте колонку лизирующим буфером 1%cile и с помощью фракционного коллектора элюируйте фракции объемом 0,25 мл. Инкубируйте 125 µL из каждой фракции с 500 µL предварительно охлажденного метанола при -20 °C в течение двух часов. Центрифугируйте образцы при 13 000 ×g в течение 30 минут при 4 °C.

Растворите осадок в 20 µL буфера для образцов с SDS, прокипятите в течение 10 минут. Охладите до комнатной температуры и проведите разделение на 15% полиакриламидных гелях. Используйте стандартную кривую для экстраполяции молекулярных масс различных восстановленных видов PRP для конъюгации молекулы G five P с магнитными бусинами.

Инкубируйте 100 µg G5P с 350 µL активированных магнитных частиц TOCI в 1 mL PBS при 37 °C в течение 20 часов. Используйте внешний магнит, чтобы притянуть частицы G5P к стенке пробирок Eppendorf, и удалите раствор. Промойте частицы трижды 1 mL PBS с 0,1% BSA для блокирования неспецифического связывания.

Инкубируйте частицы, конъюгированные с G5P, в 1 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 7.4), содержащего 0.1% BSA, в течение пяти часов при 37 °C. Затем промойте частицы трижды. Удалите последний промывочный раствор и добавьте 1 mL PBS для выделения PRP. Инкубируйте 100 µL S1 или P2 с 60 µL частиц, конъюгированных с G5B, в 1 mL связывающего буфера при постоянном перемешивании в течение трех часов при комнатной температуре.

Поместите пробирку на магнит. Удалите раствор и трижды промойте гранулы промывочным буфером. Удалите финальный промывочный раствор и добавьте буфер для образцов с SDS.

Нагрейте гранулы при 95 °C в течение пяти минут. Нанесите образцы на готовые 15% гели и проводите электрофорез при 150 В примерно 80 минут. Перенесите белки на PVDF-мембрану при 70 В в течение двух часов после блокировки мембран 5% молоком в TBST.

Инкубируйте их в течение двух часов при комнатной температуре с антителами к PRP. 3F4, 1E4, анти-N или анти-C. После инкубации с конъюгированными с HRP вторичными антителами инкубируйте мембрану в растворе для хемилюминесценции согласно инструкциям производителя и экспонируйте пленку, как показано здесь, в сравнении с образцами при спорадической болезни Крейтцфельта-Якоба или CJD. В P2-фракции нормального мозга было обнаружено небольшое количество нерастворимого клеточного PRP.

Однако большая часть была обнаружена во фракции S two. Нерастворимый PRP составляет примерно от 5 до 25% от общего количества PRP, включая полноразмерные и усеченные с концов формы; анализ с использованием ступенчатого осаждения в сахарозном градиенте показал, что в то время как большая часть PRPC из головного мозга при отсутствии CJD была обнаружена в верхних фракциях one three, небольшое количество PRP также было выявлено в нижних фракциях nine 11, в которых обычно содержатся крупные агрегаты. Различные патогенные PRP или формы PRP SC варьируют от мономеров.

Мелкие лиганды и более крупные агрегаты были выделены методом гель-фильтрации из мозга с болезнью Крейтцфельта-Якоба. Удивительно, но небольшое количество более крупных агрегатов с молекулярной массой более 2000 кДа также было обнаружено в нерастворимых фракциях мозга нормальных особей. Более того, димеры и тетрамеры PRPC были обнаружены не только в нерастворимых фракциях, но и в самих нерастворимых фракциях.

После обработки PK и PNGase. PRP, захваченный G five P, был обнаружен с помощью антитела one E four против PRP 97 1 0 5 3. Были обнаружены устойчивые к PK фрагменты ядра, названные PRP asterisk 20, PRP asterisk 19 и PRP asterisk seven, которые мигрировали на уровне 20 kDa, 19 kDa и 7 kDa соответственно.

Однако PRP не обнаруживалось, когда антитело one E four предварительно инкубировали с синтетическим пептидом, имеющим последовательность, идентичную эпитопу one E four, что указывает на то, что полосы, обнаруженные с помощью one E four, являются фрагментами PRP. Антитело anti C обнаружило два различных фрагмента PRP с миграцией примерно на уровне 18 килодальтон и около 12–13 килодальтон. В дополнение к PRP ETE 20 Once method.

При правильном выполнении данная методика занимает четыре дня. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как изолировать растворимые и нерастворимые полиглутаматы PRP в нижних отделах головного мозга человека после их развития. Эта методика открыла путь для исследований судьбы PIP с целью изучения подтверждающей информации о PIP в мозге.