Первичная изоляция Микроглия из смешанного глиальных клеточных культур из тканей новорожденных мозга крысы

Общая цель этой процедуры заключается в получении первичных культур микроглиальных клеток из мозга неонатальных крыс. Это достигается путем первичной изоляции мозга и удаления мозговых оболочек. Второй шаг заключается в гомогенизации мозга и смешивании глиальной культуры в колбах с Т-75.

Затем колбы инкубируют в течение 10-14 дней до тех пор, пока монослой астроцитов не достигнет слияния. Заключительным этапом является встряхивание колб, чтобы высвободить микроглию, которая растет поверх монослоя астроцитов, в результате чего получается очищенная культура микроглии. В конечном счете, первичная микроглия высокой чистоты может быть использована в последующих анализах in vitro на одноклеточную культуру и ко-культуру.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как метод градиента Перико, заключается в том, что номинальное механическое разрушение сводит к минимуму дисфункцию или активацию микроглии, и микроглия для экспериментов может генерироваться в течение нескольких недель после первоначальной подготовки. Я продемонстрирую эту процедуру вместе с Тэмми Теро, аспиранткой в лаборатории доктора Клифтона Дау. Культуры микроглии высокой чистоты, полученные в ходе этого протокола, могут быть использованы в экспериментах in vitro для изучения функции микроглии в нормальных физиологических условиях, а также в условиях патологического заболевания.

Микроглия, реакция на повреждение тканей, а также воспалительные раздражители имеют непосредственное отношение к неврологическим травмам и нейродегенеративным заболеваниям. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что они не знают, как своевременно удалять мозговые оболочки из ткани мозга, чтобы уменьшить загрязнение фибробластами в первичных культурах микроглии. Кроме того, следует соблюдать осторожность, чтобы не повредить монослой астроцитов во время встряхивания колб и работы с культурами микроглии.

Чтобы подготовиться к процедуре, Чи Ливи нагревают L 15 среды до четырех градусов Цельсия, готовы чашки Петри размером 60 на 15 миллиметров, содержащие L 15 среды, и помещают на лед. Нагрейте питательную среду до 37 градусов Цельсия и убедитесь, что все хирургические инструменты стерилизованы. После того, как вы обезглавите щенка крысы от одного до пяти раз острыми ножницами, опустите голову в 70% этанол.

После того как головы пяти крысят будут собраны, переложите головы в солевой раствор. Удалите весь мозг из каждой головы, осторожно сделав надрезы с обеих сторон черепа над ушами и вытащив мозг наружу в одну из областей Петри, содержащую L 15 на льду. После того, как первые пять мозгов были перенесены в L 15 на льду, следующие пять детенышей могут быть обработаны таким же образом, когда все мозги будут собраны.

Удалите мозговые оболочки, аккуратно взявшись щипцами за край менингеального листа и осторожно отодвинув его от нижележащей коры. Важно тщательно удалить мозговые оболочки и сделать это как можно быстрее. После удаления мозговых оболочек переложите каждый из мозгов в свежую чашку Петри со средой L 15 на льду.

С помощью пипетки объемом 10 миллилитров отсасывайте мозговую ткань и среду из планшета в стерильную коническую трубку объемом 50 миллилитров. Затем центрифугируйте при 2500 RCF в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования аспират.

Затем супинат использует стерильную пипетку объемом 10 миллилитров для Риза. Суспендируйте гранулу в четырех-пяти миллилитрах свежей среды L 15, пипеткой вверх и вниз 10 раз. Затем поместите 100-микронный фильтр для пористых клеток на свежую коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

С помощью стерильной пятилитровой пипетки нагнетайте тканевую суспензию вверх и вниз, а затем, промыв пипетку к сетчатому фильтру, распределите материал через клеточный фильтр в коническую трубку. Промойте ситечко четырьмя-пятью миллилитрами свежего охлажденного фильтрующего материала L 15. Затем центрифугируйте 2,500 RCF в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Для обработки мозга каждого крысятенка приготовьте стерильную колбу с Т-75, добавив в каждую колбу 12 миллилитров довоенной питательной среды. Затем, после отсасывания супнатанта из гранулированных клеток, добавьте пять-шесть миллилитров питательной среды в клеточную гранулу, пипетируйте вверх и вниз 10 раз с помощью пипетки объемом 10 миллилитров. Затем переложите равный объем клеточной суспензии в каждую колбу Т 75.

Инкубируйте колбы в инкубаторе с 5% содержанием углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной-трех недель, позволяя клеткам спокойно находиться в течение первых пяти дней после первоначального осаждения. Через пять дней замените кондиционированную среду в каждой колбе на 12 миллилитров свежей среды для достижения слияния. Делать это нужно очень аккуратно, не касаясь дна колбы, где крепятся ячейки.

Как только смешанные глиальные культуры полностью сойдутся, извлеките колбу из инкубатора. Накройте крышки колб параметром, чтобы предотвратить газообмен с воздухом из окружающей среды, и поместите колбы в встряхивающий инкубатор, установленный на 100 об/с и 37 градусов Цельсия на час по истечении часа, с помощью пипетки объемом 10 миллилитров соберите среду из колб без нарушения слоя астроцитов и распределите в конические пробирки объемом 50 миллилитров. Добавьте в колбы свежие среды и верните в инкубатор.

После центрифугирования пробирок при температуре 2500 RCF в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия аспирируйте супинат и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре среды для покрытия микроглии. Затем подсчитывают клетки с помощью человеческого цитометра и стандартных процедур. После того, как количество клеток будет определено, добавьте соответствующий объем микроглиальной среды для получения клетки.

Концентрация в два раза по 10 на пять клеток на миллилитровую пластину подходит для проведения эксперимента и возврата в инкубатор. Дать микроглии прикрепиться на ночь. Клетки были иммуноокрашены антителами, специфичными для IBA, микроглиальным маркером, который выглядит красным.

Контаминация культуры нейрональными клетками минимальна, как показано на этом микроскопическом изображении иммуноокрашивания с использованием антитела к новому нейрональному маркеру NA, который отображается красным цветом. На предметном стекле есть счетчики, окрашенные DPI, чтобы окрасить все ядра клеток в синий цвет. На этом изображении показано иммуноокрашивание с помощью GFAP и астроцитарного маркера.

Астроциты выглядят зелеными. Здесь мы видим изображение микроглиальной культуры, иммуноокрашенной антителом, специфичным к CC one, маркером олигодендроцитов. Олигодендроциты выглядят красными.

На этой гистограмме показаны результаты количественной оценки каждого типа клеток. Видно, что покрытые микроглиальные культуры имеют чистоту более 90%. На этом изображении флуоресцентного микроскопа показана культура микроглии, которая была иммуноокрашена для IBA.

Красные участки — это латексные бусины с флуоресцентной маркировкой. Показанная здесь культура микроглии была обработана одним нанограммом на миллилитр липополисахарида, и можно видеть, что клетки микроглии имеют фагоцитоз флуоресцентно меченных латексных шариков. Здесь результаты анализа фагоцитоза отображаются в виде гистограммы.

Усиление фагоцитоза наблюдается после лечения ЛПС. Этот рисунок показывает, что продукция оксида азота также увеличивается в культурах микроглии после добавления ЛПС. Наконец, как прямые, так и трансвелловые культуры разделенных нейронов микроглии подвержены повышенной гибели клеток после инкубации с ЛПС, что измеряется высвобождением лактатдегидрогеназы После освоения первой части этого метода, вплоть до вливания в T 75, колбы могут быть выполнены в течение полутора часов, а полная процедура может быть выполнена в течение двух недель.

Еще одним соображением при оптимизации этого протокола является определение продолжительности времени. Смешанные глиальные культуры следует поддерживать перед выделением первичной микроглии для гальванического покрытия после создания культур высокой чистоты. С помощью этой процедуры можно оценить функцию микроглии in vitro, измеряя выработку оксида азота, высвобождение цитокинов и хемокинов, а также фазовую активность и измеряя с помощью рутинных лабораторных анализов.

Таким образом, с развитием этой процедуры исследователи в области нейробиологии имеют возможность изучать активность микроглии в однородной клеточной среде и исследовать ее роль при различных неврологических состояниях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить первичные культуры микроглиальных клеток из мозга неонатальных крыс. Сначала изолируя мозг и удаляя мозговые оболочки, а затем гомогенизируя мозг и помещая их в колбы, колбы инкубируют в течение 10-14 дней, пока монослой астроцитов не достигнет слияния.

Последним шагом является встряхивание колб, чтобы высвободить микроглию, которая растет поверх монослоя астроцитов, в результате чего получается очищенная культура микроглии.