Культивирование прав нервные клетки-предшественники в 3-мерном самоорганизации пептидов Гидрогель

Общая цель данной процедуры заключается в ускорении анализа нейрональной дифференцировки прогениторных клеток человека, культивируемых в трехмерной среде. Это достигается путем предварительного культивирования клеток в чистом матриксе на основе самособирающегося пептидного гидрогеля. Затем клетки высвобождаются из трехмерных каркасов.

На третьем этапе проводится иммуно-фитохимическое окрашивание клеток. Подсчет клеток осуществляется с помощью проточного цитометрического анализа. В конечном итоге с помощью данного анализа по соответствующим нейрональным или апоптотическим маркерам можно определить степень нейрональной дифференцировки или уровень апоптоза.

Благодаря данной методике количественная оценка нейрональной дифференцировки проходит значительно быстрее, а данные Optane объединяются с более широкой базой и методами микрофотографии. Для встраивания клеток в чистый матрикс сначала поместите стерилизованное предметное стекло диаметром 13 мм в каждую из двух лунок четырехлуночного планшета для культивирования клеток. Затем поместите планшет в чистую зону (ламинарный шкаф) для последующего использования. Далее отделите человеческие нейрональные клетки-предшественники (H NPCs), добавив 2,5 мл свежеприготовленного трипсина.

Добавьте раствор Benzon в чашку с культурой и инкубируйте клеточную суспензию при 37 °C и 5% carbon dioxide. Через пять минут остановите реакцию с помощью раствора ингибитора трипсина Benzon. Затем, после осаждения отделившихся клеток центрифугированием при 3000 ×g при комнатной температуре в течение пяти минут, ресуспендируйте полученный осадок в пяти миллилитрах 10% раствора sucrose, после чего промойте клеточную суспензию при тех же условиях центрифугирования.

После удаления супернатанта Resus ресуспендируйте осадок в растворе сахарозы до конечной концентрации клеток 1 × 10⁶ клеток/мл. Затем как можно быстрее смешайте 60 µL клеточной суспензии с раствором один; перенесите 120 µL этой суспензии в коническую пробирку с раствором два, осторожно перемешайте и немедленно нанесите по 100 µL смеси на каждое покровное стекло в четырехлуночной планшетке. В завершение медленно добавьте по 200 µL среды для культивирования клеток в каждую лунку.

Через две-три минуты добавьте в лунки еще 200 µL среды для культивирования клеток, чтобы инициировать самосборку матрикса. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение одного часа на подогреваемой поверхности вашего стерильного бокса. Стараясь максимально не перемещать планшет с клетками после формирования матриксов, с помощью пипетки на 1000 µL удалите большую часть среды, но не всю, чтобы предотвратить высыхание матриксов.

Затем промойте матрицы 500 µL свежей среды в течение 10 минут. В завершение удалите промывочную среду. Добавьте еще 500 µL среды и поместите культуральную пластину в инкубатор.

По возможности храните матрицы в отдельном инкубаторе, чтобы избежать случайного встряхивания структур в первый день эксперимента по окрашиванию. Удалите среду из матриц с помощью 1000 мкл пипеток, затем промойте скаффолды в PBS один раз в течение пяти минут.

Затем удалите PBS и добавьте в каждую лунку 400 µL паральдегида для фиксации матриксов, после чего инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре. После фиксации скаффолдов промойте их 500 µL PBS в течение пяти минут. Затем инкубируйте структуры в блокирующем буфере от шести до девя не часов, заменяя буфер каждые два-три часа; завершите процедуру окончательной инкубацией в свежем блокирующем буфере в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день удалите блокирующий буфер.

Добавьте раствор антител в лунки и повторно инкубируйте матрицы при температуре четырех градусов Цельсия в течение ночи. Затем удалите раствор первичных антител и промывайте скаффолды в 500 microliters PBS в течение восьми часов, заменяя PBS каждые два часа, а затем в течение ночи при четырех градусах Цельсия со свежим PBS. После ночной промывки удалите PBS и инкубируйте скаффолды с раствором вторичных антител в течение четырех часов при комнатной температуре в темном месте.

Затем промойте образцы в PBS от четырех до шести раз, по одному часу за каждую промывку, после чего инкубируйте структуры в свежем PBS при температуре четырех градусов Цельсия в темноте в течение ночи. Теперь нанесите по 50 мкл MOE all dab co на предметные стекла микроскопа, чтобы подготовить их к монтажу матриц. Затем осторожно накройте каждое стекло покровным стеклом.

Наконец, используйте флуоресцентный микроскоп для получения одиночных микрофотографий, подобных тем, что представлены здесь, где hNPCs окрашены в зеленый цвет для визуализации экспрессии нейронального маркера бета-III тубулина. После промывки скаффолдов 500 µL HBSS в течение одной минуты перенесите скаффолды в коническую пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки на 1000 µL. Затем несколько раз ресуспендируйте клеточный раствор пипеткой на 1000 µL для механического разрушения матриц, после чего центрифугируйте раствор скаффолдов при 3000 ×g при комнатной температуре в течение пяти минут; удалите супернатант пипеткой, а затем ресуспендируйте осадок в 500 µL раствора трипсин-бензоина, несколько раз прокачивая его через наконечник пипетки.

Затем инкубируйте клетки при 37 °C. Остановите реакцию через пять минут, добавив 1 мл раствора ингибитора трипсина и бензоназы, несколько раз пропипетировав смесь. Осадите клеточную суспензию, центрифугировав ее в тех же условиях.

Удалите остатки матрикса, дважды промыв клетки двумя миллилитрами буфера HBSS. Затем удалите агрегаты, пропустив суспензию клеток через центрифужный сеточный фильтр для клеток с размером пор 70 микрон при тех же условиях, и соберите клетки в среду для культивирования клеток. Начните с фиксации дезагрегированных клеток в 1% параформальдегиде в течение 15 минут при комнатной температуре на шейкере.

Затем после осаждения клеток ресуспендируйте осадок в буфере для промывки. После центрифугирования клеток в течение 10 минут при 350 ×g при температуре 4 °C ресуспендируйте полученный осадок в 25 µL раствора антител. Инкубируйте суспензию клеток в течение двух часов при комнатной температуре на шейкере.

Затем добавьте 300 µL буфера PON непосредственно к образцам, после чего дважды промойте клеточные суспензии при тех же условиях центрифугирования. После второго промывания добавьте 25 µL вторичного антитела и инкубируйте клетки в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Затем, после повторного двукратного промывания клеток сапониновым буфером, ресуспендируйте осадок в 500 µL промывочного буфера для проведения проточного цитометрического анализа.

На данном рисунке показаны H NPCs, инкапсулированные в чистый матрикс; клетки растут в форме сфер — плотно упакованных структур, диаметр которых может достигать нескольких сотен микрон. Между сферами наблюдаются пучки отростков, созданные клетками, на что указывают белые стрелки. Хотя отдельные клетки практически неразличимы, клетки, инкапсулированные в чистый матрикс с добавлением ламинина, растут в менее плотных структурах и распределены более однородно, как видно на этом рисунке; в менее плотных областях можно даже распознать отдельные клетки, на что указывают черные стрелки. Здесь представлены H NPCs, дифференцированные в течение четырех дней в матриксе с добавлением ламинина, окрашенные в зеленый цвет для выявления экспрессии нейронального маркера.

Бета-III тубулин показан для оценки процента положительных клеток. Общее количество клеток может быть определено путем подсчета ядер клеток, окрашенных здесь в синий цвет с помощью DAPI. Эта микрофотография представляет собой полную проекцию Z-стека снимков, полученных с помощью флуоресцентного микроскопа.

Клетки, высвобожденные из матрицы, можно повторно высеять, например, на покровные стекла, как показано на этом рисунке, для дальнейших функциональных исследований. На этой микрофотографии представлены клетки, культивируемые в 3D после проведения вышеупомянутой процедуры высвобождения и трехдневного культивирования. Окрашивание на бета-III-тубулин красным цветом демонстрирует морфологию, сопоставимую с клетками, содержащимися в 3D-каркасе, при использовании неокрашенных клеток в качестве отрицательного контроля.

Область анализа (GA), представленная здесь в виде черного контура, была установлена для последующего анализа бета-3-тубулин-положительных клеток; на данной диаграмме рассеяния положительные клетки располагаются внутри черного контура в правой части оси x, а также наблюдается промежуточная популяция в пунктирном контуре, которая, скорее всего, представляет собой клеточный детрит. На этом заключительном рисунке показано сравнение ручного подсчета клеток и перечисления методом проточной цитометрии. С помощью проточного цитометрического анализа (обозначено открытыми черными квадратами) можно обнаружить значительно более высокую долю положительных клеток, чем обычно выявляется при ручном подсчете (обозначено закрашенными черными треугольниками).

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать показатели качества для культивирования краевых MPC в 3D-каркасе, а также о том, как высвобождать клетки из каркаса для анализа на проточных цитометрах.