Культивирование прав нервные клетки-предшественники в 3-мерном самоорганизации пептидов Гидрогель

Общая цель этой процедуры заключается в ускорении анализа нейронной дифференцировки нейронных клеток-предшественников человека, культивируемых в трехмерной среде. Это достигается путем предварительного культивирования клеток в самоорганизующейся чистой гидрогелевой чистой матрице на основе пептидов. Затем клетки освобождаются от трехмерных каркасов.

На третьем этапе выполняется иммунофитохимическое окрашивание клеток. Клетки подсчитываются с помощью проточного цитометрического анализа. В конечном счете, скорость дифференцировки нейронов или скорость апоптоза могут быть определены с помощью проточного цитометрического анализа нейрональных или апоптотических маркеров соответственно.

С помощью этого метода количественная оценка нейронной дифференцировки происходит намного быстрее, а данные Optane устремляются вверх в более широкую базу и методы микрофотографирования Для встраивания клеток в чистую матрицу сначала поместите стерилизованную стеклянную крышку диаметром 13 мм в каждую из двух лунок четырехлуночного планшета для культивирования клеток. Затем храните тарелку на чистой скамейке для последующего использования. Затем отделите человеческие нервные клетки-предшественники или H-NPC, добавив 2,5 миллилитра свежеприготовленного трипсина.

Бензон в раствор для культивирования в чашке и инкубации клеточной суспензии при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе. Через пять минут прекратите реакцию с помощью ингибитора трипсина бензона раствором. Затем, раскрутив оторвавшиеся клетки при 3000-кратном G при комнатной температуре в течение пяти минут, резус суспендирует полученную гранулу пятью миллилитрами 10%-ного раствора сахарозы, а затем промывает клеточную суспензию в тех же условиях центрифуги.

После выброса snat Resus суспендируйте гранулу в растворе сахарозы до конечной клеточной концентрации от 10 до 10 до шести клеток на миллилитр. Теперь как можно быстрее смешайте 60 микролитров клеточной суспензии с раствором один, переложите 120 микролитров этой суспензии в коническую пробирку с раствором два и тщательно перемешайте, а затем сразу же наложите по 100 микролитров смеси на каждый из покровных стекол в четырехлуночной пластине. Наконец, медленно добавьте по 200 микролитров среды для клеточных культур в каждую лунку.

Через две-три минуты добавьте еще 200 микролитров клеточных культуральных сред в лунки, инициирующие самосборку матрицы. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа на отапливаемой площадке чистого стола. Воздерживаясь от перемещения планшета для клеточной культуры как можно дальше после того, как матрицы собраны, используйте пипетку объемом 1000 микролитров для удаления большей части, но не всей среды, чтобы избежать высыхания матриц.

Затем промойте матрицы 500 микролитрами свежего средства в течение 10 минут. Наконец, удалите промывочный материал. Добавьте еще 500 микролитров среды и поместите планшет с культурой в инкубатор.

Если это возможно. Храните матрицы в собственном инкубаторе, чтобы избежать случайной тряски конструкций в первый день эксперимента по окрашиванию. Удалите носители из матриц с помощью пипетки объемом 1000 микролитров, а затем промойте каркасы PBS один раз в течение пяти минут.

Затем снимите ПБС и добавьте в каждую лунку по 400 микролитров паральдегида для фиксации матриц и выдержите их в течение 30 минут при комнатной температуре. После того как строительные леса будут закреплены, промойте их 500 микролитрами PBS в течение пяти минут. Затем инкубируйте структуры и блокирующий буфер в течение шести-девяти часов, меняя буфер один раз в два-три часа с окончательной ночной инкубацией в свежем блокирующем буфере при четырех градусах Цельсия на следующий день, удалите блокирующий буфер.

Добавьте раствор антитела в лунки и снова инкубируйте матрицы при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Теперь удалите первичный раствор антитела и промойте каркасы в 500 микролитрах PBS в течение восьми часов, меняя PBS каждые два часа, а затем на ночь при четырех градусах Цельсия со свежим PBS. После ночной промывки удалите PBS и инкубируйте скаффолды с раствором вторичного антитела в течение четырех часов при комнатной температуре в темноте.

Затем промойте образцы PBS от четырех до шести раз в течение одного часа каждый раз, а затем инкубируйте структуры со свежим PBS при четырех градусах Цельсия в темноте на ночь. Теперь добавьте 50 микролитров MOE all dab co на предметные стекла микроскопа, чтобы подготовить их к монтажу матриц. Затем аккуратно закрепите крышку на каждой горке.

Наконец, используйте флуоресцентный микроскоп для получения одиночных микрофотографий и Zacks, похожих на H NPC, окрашенных в зеленый цвет для экспрессии нейронного маркера бета-3 тубулина, показанного здесь. После промывки скаффолдов 500 микролитрами HBSS в течение одной минуты используйте пипетку на 1000 микролитров, чтобы перенести скаффолды в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Далее повторно суспендируйте клеточный раствор несколько раз пипеткой объемом 1000 микролитров для механического разрушения матриц и впоследствии центрифугируйте раствор скаффолда при 3000-кратном G при комнатной температуре в течение пяти минут, удалите надосадочную жидкость пипеткой и затем повторно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах раствора трипсина бензина путем пипетирования вверх и вниз несколько раз.

Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов по Цельсию. Купируйте реакцию через пять минут с помощью одного миллилитра ингибитора трипсина. Раствор бензаназы пипетируют вверх и вниз несколько раз после раскручивания клеточной суспензии в тех же условиях центрифуги.

Удалите любой мусор матрицы, промыв клетки двумя миллилитрами буфера HBSS два раза. Наконец, удалите агрегаты, пропустив раствор клеточной суспензии через центрифугу с клеточным фильтром 70 микрон в тех же условиях, и соберите клетки в среду для культивирования клеток. Начните с фиксации дезагрегированных клеток в 1%-ном параформном паральдегиде в течение 15 минут при комнатной температуре на шейкере.

Затем, после раскрутки ячеек, суспензируйте гранулу в промывном буфере. Теперь после центрифугирования клеток в течение 10 минут при 350-кратном G при четырех градусах Цельсия Реус суспендируют полученную гранулу в 25 микролитрах раствора антитела. Выдержать клеточную суспензию в течение двух часов при комнатной температуре на шейкере.

Затем добавьте 300 микролитров буфера пон непосредственно к образцам, а затем дважды промойте клеточные суспензии в одних и тех же условиях центрифуги. После второго промывания добавьте 25 микролитров вторичного антитела, а затем инкубируйте клетки в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Затем, промыв клетки еще два раза сапониновым буфером, резус суспензируют гранулу и 500 микролитров промывочного буфера для проточного цитометрического анализа.

На этом рисунке H показаны инкапсулированные и чистые матрицы NPC, клетки которых растут в сферах, плотно упакованных структурах, где диаметр сфер может составлять до нескольких сотен микрон между сферами. Пучки процессов, создаваемых клетками, можно наблюдать, как показано белыми стрелками. Хотя отдельные клетки едва ли могут быть распознаны, клетки, инкапсулированные в чистый матрикс, дополненный ламинином, растут в менее плотных структурах и более равномерно распределены, как видно на этом рисунке, отдельные клетки могут быть распознаны даже в менее плотных областях, как показано черными стрелками.

Показано, что бета-три тубулина оценивают процент положительных клеток. Общее количество клеток можно определить, перечислив ядра клеток, окрашенных здесь в синий цвет с лепечкой. Эта микрофотография представляет собой полную проекцию Z-стопки изображений, сделанных с помощью флуоресцентного микроскопа.

Клетки, высвобожденные из матрицы, могут быть снова размещены, например, на покровных листах, как показано на этом рисунке, для дальнейших функциональных исследований. На этой микрофотографии показаны клетки, культивируемые в 3D после того, как они были подвергнуты ранее упомянутой процедуре высвобождения и культивировались в течение трех дней. Окрашивание бета-3 тубулина красным цветом показывает морфологию, сравнимую с клетками, размещенными в 3D-каркасе с использованием неокрашенных клеток в качестве отрицательного контроля.

ГА, представленная здесь в виде черной рамки, была установлена для последующего анализа бета-трех тубулиноположительных клеток на этой точечной диаграмме, положительные клетки появляются в черной рамке в правой части оси x и промежуточная популяция в пунктирной рамке и, скорее всего, представляющая собой клеточный мусор, также могут наблюдаться. Сравнение ручного подсчета клеток и подсчета с помощью проточной цитометрии показано на этом окончательном рисунке. Гораздо более высокая доля положительных клеток может быть обнаружена с помощью проточного цитометрического анализа, на что указывают открытые черные квадраты, а затем обычно может быть пересчитана с помощью ручного подсчета, как указано сплошными черными треугольниками.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать плохие метрики для культивирования краевых MPC в 3D скаффолде и как освободить клетки от скаффолда для проточных цитометрических анализаторов.