Многофотонной микроскопии Сбрасывается мозга мыши выражая YFP

Мультифотонная микроскопия фиксированных тканей обычно ограничена малой глубиной проникновения, составляющей всего несколько сотен микрон. Недавно мы впервые продемонстрировали применение мультифотонной микроскопии на глубине до нескольких миллиметров в фиксированных органах мыши с использованием оптического просветления раствором бензоилового спирта и бензоилбензоата. В нашей первоначальной демонстрации с помощью этого метода была визуализирована собственная флуоресценция тканей.

Тем не менее, растет интерес к применению методов оптического просветления тканей, экспрессирующих флуоресцентные белки, такие как GFP. В данной работе мы представляем протокол мультифотонной микроскопии просветленной ткани мозга с использованием того же раствора бензоспирта, который сохраняет флуоресценцию желтого флуоресцентного белка, экспрессируемого под действием одного промотора в мозге мыши. Высокое разрешение при визуализации целых органов мыши с помощью мультифотонной микроскопии становится возможным благодаря оптическому просветлению органа перед визуализацией без просветления. Мультифотонная микроскопия.

Визуализация мозга ограничена глубиной 300 микрон под поверхностью ткани из-за эффектов рассеивания света, возникающих вследствие разницы показателей преломления воды и белков, составляющих ткань мозга. Чтобы преодолеть это ограничение, орган подвергают дегидратации, при которой вода заменяется жидкостью, имеющей показатель преломления, близкий к показателю преломления белков ткани. Этот процесс оптического просветления помогает значительно снизить рассеивание света, что позволяет улучшить качество визуализации на больших глубинах под поверхностью ткани.

Изображения из работы Batta et al демонстрируют, как данный метод может быть применен для изучения гистологии различных органов мыши с использованием собственной флуоресценции и генерации второй гармоники. На этом первом изображении представлено семенное яичко мыши, снимок сделан на глубине 1,4 millimeters под поверхностью ткани. Высокое разрешение многофотонной микроскопии позволяет увеличить изображение и детально рассмотреть отдельные сперматозоиды, формирующиеся в семенных канальцах.

Как видно в крайней правой части, здесь представлено изображение легкого мыши, которое также было получено на глубине 1,4 millimeters под поверхностью ткани. Данное изображение демонстрирует двухканальную многофотонную визуализацию, при которой компоненты эластина помечены красным, а коллаген — зеленым; при увеличении отдельные волокна легко различимы. Наконец, мы представляем изображения внутреннего отдела мозга мыши с высоким разрешением, полученные на глубине 850 microns под поверхностью ткани. При увеличении неокортекса и гиппокампа мозга отчетливо видны отдельные астроциты и тела нейронов.

Однако при оптическом просветлении органов, которые могут содержать флуоресцентные белки, такие как YFP, протокол оптического просветления BADRA вообще не сохраняет флуоресцентный сигнал этих белков. Протокол, представленный здесь, является новым способом проведения оптического просветления и визуализации всего органа (мозга мыши) с сохранением флуоресцентного сигнала YFP и нейронов; было обнаружено, что дегидратация мозга с использованием серии растворов этанола с возрастающей концентрацией и последующее просветление раствором бензилового спирта и бензоата в соотношении 1:2, также известным как BAB, снижает повреждение флуоресцентных белков и сохраняет их флуоресцентный сигнал. Для многофотонной визуализации мышей с YFP сначала взвешивают, а затем наркотизируют путем внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина и ксилазина.

Перед началом хирургического вмешательства необходимо подтвердить установление хирургического уровня анестезии. Состояние животного следует проверять каждые пять минут, оценивая реакцию на сильное сжатие пальца лапы или хвоста. Если животное реагирует, требуется введение дополнительной дозы кетамина и ксилазина.

После введения анестетика мышей фиксируют на операционном столе, прикрепляя каждую конечность лабораторным пластырем так, чтобы животное находилось в положении на спине с открытой для операции грудной клеткой. Для начала делают разрез ниже мечевидного отростка, затем ножницами производят разрез вдоль основания грудной клетки, используя пинцет для раздвигания кожи в процессе разреза; далее делают два разреза по обеим сторонам грудины мыши, чтобы создать тканевый лоскут, который отводят от грудной полости с помощью гемостата, оставляя сердце открытым. Затем в левый желудочек сердца вводят иглу 23-го калибра и делают небольшой разрез в мышечной стенке правого предсердия для оттока крови. Сразу после разреза правого предсердия начинают перфузию фосфатно-солевым буферным раствором при температуре 4 °C до тех пор, пока кровь перестанет вытекать из правого предсердия.

Во время перфузии используется перистальтический насос, мощность которого настроена таким образом, чтобы жидкость вылетала на расстояние от 1,5 до 2 дюймов от кончика иглы. После полного удаления крови перфузионная среда заменяется 4% раствором параформальдегида при температуре 4 °C до тех пор, пока тело мыши не станет заметно ригидным и твердым. После завершения перфузии мышь снимают с операционного стола и декапитируют, после чего при помощи пинцета и ирисных ножниц приступают к извлечению головного мозга.

Череп удаляют небольшими фрагментами, начиная с затылочной части и продвигаясь вперед. Ножницами делают небольшие надрезы через каждые два-четыре миллиметра по всей ширине черепа, при этом с помощью пинцета осторожно отделяют кость от мозга небольшими участками; процедуру повторяют до полного обнажения всей верхней поверхности мозга. Затем мозг извлекают из черепной коробки с помощью хирургической шпателя и помещают в стеклянный флакон с 4% параформальдегидом для фиксации в течение шести часов.

Хотя в данной демонстрации основное внимание уделяется визуализации мозга мыши, экспрессирующего YFP, для наиболее полной демонстрации возможностей данного метода оптического просветления будут также обработаны задняя конечность мыши и срез тонкого кишечника. После постфиксации мозг и другие ткани дважды промывают в PBS. Затем образцы тканей дегидратируют при комнатной температуре путем последовательной инкубации в растворах этанола с концентрацией 50%, 70%, 90% и 100%.

Каждая инкубация длится два часа, после чего проводится вторая инкубация в 100% этаноле в течение 12 часов для эффективного удаления воды из фиксированной ткани. После обезвоживания последнюю порцию 100% этанола сливают, и образцы ткани погружают в смесь этанола и BAB в соотношении один к одному на два часа, после чего их переносят в 100% раствор BAB для просветления.

После помещения в BAB мозг и другие образцы тканей заметно станут прозрачными в течение четырех-пяти часов. Здесь мы представляем видео с ускоренной съемкой первых шести часов процесса оптического просветления. Разрыв в записи отмечает момент, когда раствор этанола и BAB в соотношении 1:1 был заменен 100% раствором BAB.

По истечении шести часов все органы становятся прозрачными; например, для достижения наилучшего результата просветления кость в задней лапе мыши теперь должна быть четко видна. Мозг следует оставить для просветления на шесть дней при комнатной температуре в защищенном от яркого света месте. После того как мозг станет прозрачным и будет готов к визуализации, его закрепляют на дне чашки Петри с помощью акрилового клея Sano или суперклея.

После высыхания клея мозг погружают в BAB, а чашку Петри помещают под объектив для визуализации. Для визуализации мы используем мультифотонный микроскоп со встроенным титан-сапфировым лазером MI tie, длина волны возбуждения которого регулируется в диапазоне от 710 до 990 нанометров. Для генерации сигналов YFP мы используем длину волны возбуждения 886 нанометров.

Затем отраженный флуоресцентный сигнал регистрируется с помощью объектива NIK icon 5x, который обеспечивает получение изображений с широким полем зрения. Отраженный флуоресцентный сигнал фильтруется с использованием полосового фильтра 5 35 50 и собирается с помощью фотоумножителя с высоким квантовым выходом. Полученные с помощью OMA Matsu изображения обрабатываются в программном обеспечении scan image с разрешением 2048 by 2048 пикселей и скоростью сканирования 2 мс на линию для создания YFP-изображений высокого разрешения.

После завершения визуализации мозг извлекают из чашки P two, помещают в BAB и хранят в защищенном от света месте для последующей визуализации. Представленные здесь репрезентативные изображения и видео демонстрируют возможности многофотонной визуализации высокого разрешения, ставшие возможными благодаря оптическому просветлению. Визуализация всего мозга позволяет четко видеть нейроны, меченные YFP, в различных слоях гиппокампа и неокортекса на глубине до двух миллиметров под поверхностью ткани.

Здесь мы представляем видео стек изображений толщиной 1,2 мм всего препарата полости рта, полученных на глубине от 0,8 до 2 мм в мозг для выявления различных анатомических слоев гиппокампа. Ниже приведено репрезентативное изображение коронального среза толщиной 1,94 мм, относящегося к области Бергмана, взятое из стека изображений глубиной 2 мм, на котором отмечены различные слои гиппокампа. При увеличении неокортекса становятся четко различимы отдельные аксоны и тела нейронов пирамидных клеток пятого слоя неокортекса на глубине до 1,02 мм под поверхностью ткани.

Здесь представлен стек изображений нейронов пятого слоя, полученный на глубине от 700 до 1020 мкм под поверхностью ткани. Ниже приведено репрезентативное изображение из этого стека, сделанное на глубине 774 мкм в ткани мозга. На основе этого же стека изображений с помощью программного обеспечения Image J была выполнена 3D-реконструкция области нейронов.

Высокое разрешение мультифотонной микроскопии также позволяет нам представлять изображения отдельных нейронов целиком. Здесь мы демонстрируем реконструкцию нейрона пятого слоя неокортекса, в которой четко видны дендритные процессы. На этом завершается наш обзор метода оптического просветления всего мозга мыши, экспрессирующего YFP.

Выполнение данной методики относительно просто и, как мы показали, позволяет визуализировать и получать изображения многих различных областей и структур мозга мыши. Благодарим за просмотр и желаем успехов.