Оптических изображений домена частоты

Эндобронхиальная ОКТ или OFDI проводится с использованием тонких гибких катетеров, совместимых со стандартными портами доступа бронхоскопа. Бронхоскоп продвигают по трахеобронхиальному дереву до нужного отдела дыхательных путей. Затем катетер OFDI вводят в дыхательные пути через рабочий канал бронхоскопа для сбора изображений.

Внутреннее оптическое ядро катетера OFDI вращается и одновременно вытягивается назад внутри внешней прозрачной оболочки для получения трехмерных данных OFDI. Лаборатория Судора в Массачусетском общем госпитале разработала катетер OFDI на базе иглы, который совместим со стандартными трансбронхиальными иглами, обычно используемыми для забора проб из периферических образований. Бронхоскоп продвигается по дыхательным путям к целевому образованию.

После того как катетер OFDI был безопасно заведен в трансбронхиальную иглу, иглу вводят в образование. Затем иглу извлекают, оставляя катетер OFDI на месте. Как и при эндобронхиальной OFDI, внутренний оптический сердечник трансбронхиального катетера OFDI вращается и одновременно вытягивается из внешней прозрачной оболочки для получения трехмерного изображения OFDI.

Гистопатологические данные, полученные in vivo, состоят лишь из небольших фрагментов биопсии, которые трудно сопоставить с большими наборами данных ОФДИ. В результате в условиях in vivo невозможно легко разработать специфические признаки визуализации патологии легких. Общая цель данного протокола заключается в получении точно соответствующих взаимно однозначных корреляций ОФДИ и гистологии на тканях ex vivo, что крайне важно для точной оценки признаков, наблюдаемых при ОФДИ, по сравнению с гистологией как «золотым стандартом».

После того как специфические критерии визуализации будут разработаны и валидированы ex vivo с помощью соответствующей поточному анализу гистологии, эти критерии можно будет применить к исследованиям in vivo. Основным преимуществом данного метода является возможность прямой корреляции между данными визуализации и гистологией, что улучшает интерпретацию признаков изображения. Чтобы подготовить систему оптической частотно-доменной визуализации (OFDI) к эксперименту, сначала включите систему визуализации, затем установите и запишите соответствующие параметры съемки.

Присоедините катетер к поворотному соединению и устройству для отвода. Этот катетер индивидуального изготовления имеет диаметр 0.8 millimeters. Прокрутите катетер и проверьте качество изображения, используя кончик пальца в перчатке, чтобы убедиться, что изображение находится в фокусе, а отношение сигнал/шум достаточное.

Для начала процедуры подготовки ткани положите одноразовую абсорбирующую салфетку на рабочую поверхность и поместите на нее образец легкого. В связи с трудностями в планировании получения тканей от пациентов, в данной видеодемонстрации будут использоваться ткани свиньи.

Найдите бронхиальный путь, входящий в резекционный образец в области ворот. С помощью отверстия шприца удалите всю видимую слизь из дыхательных путей. Пальпируйте внешнюю поверхность образца, чтобы определить положение дыхательных путей или интересующего поражения.

Раскройте дыхательные пути вдоль зонда до тех пор, пока интересующее образование не станет видимым или ощутимым под слизистой оболочкой дыхательных путей при пальпации ватным тампоном. Осторожно удалите кровь или слизь со слизистой оболочки дыхательных путей над образованием. Разместите катетер OFDI над слизистой оболочкой дыхательных путей и получите изображение.

Это необходимо для подтверждения того, что поражение находится под слизистой оболочкой дыхательных путей, а также для определения высококачественной области интереса при визуализации для последующей гистологической корреляции. После выбора области интереса в дыхательных путях отметьте две точки на ткани вдоль желаемой линии визуализации. В данном примере точки будут расположены параллельно продольной оси дыхательных путей.

Обеспечение видимости чернильных меток как при OFDI, так и при гистологическом исследовании может быть затруднительным, поэтому для визуализации меток обоими методами мы используем как проколы иглой, так и чернила. После выбора двух точек погрузите иглу с тонким кончиком и открытым просветом в краситель для маркировки тканей, затем осторожно удалите излишки чернил с внешней поверхности иглы марлей, оставив краску только внутри просвета иглы; выполните пункцию ткани перпендикулярно слизистой оболочке дыхательных путей в выбранной точке вдоль линии визуализации. Аналогичным образом отметьте вторую точку на слизистой оболочке дыхательных путей, убедившись, что расстояние от первой точки до второй не превышает 1.5 сантиметров.

Если чернила растеклись по слизистой поверхности в сторону от места прокола, аккуратно удалите излишки чернил ватной палочкой. В зависимости от желаемого результата две точки также могут быть нанесены параллельно циркумференциальной плоскости дыхательных путей, как показано здесь. Для визуализации ткани поместите катетер OFDI над каждой меткой с чернилами и выполните сканирование, чтобы убедиться, что метки видны при OFDI.

Метки должны выглядеть как очаговые нарушения структуры ткани с перекрывающими их частицами с высоким коэффициентом рассеяния и последующим резким затуханием сигнала, что соответствует частицам чернил в месте прокола. На данном OFDI-изображении дыхательных путей свиньи обе метки чернилами отмечены звездочками. Расположите катетер параллельно двум чернильным меткам на поверхности слизистой оболочки дыхательных путей так, чтобы оптика катетера находилась над участком ткани за первой чернильной меткой.

Перейдите к сбору данных с помощью метода обратного сканирования (pullback) OFDI; просмотрите полученные изображения, чтобы убедиться, что обе метки краской видны на снимках, и проверить наличие артефактов движения перед забором ткани. Поставьте точку зеленой краской на слизистой оболочке дыхательных путей на расстоянии 0.3 сантиметра от метки, которая первой появилась при обратном сканировании. Это необходимо для ориентации начала сканирования.

Теперь удалите участок ткани, охватывающий две метки черными чернилами и одну метку зелеными чернилами. Обрежьте ткань так, чтобы она поместилась в стандартную кассету для гистологической проводки. Поместите ткань в кассету для гистологической проводки и зафиксируйте в 10% формалине минимум на 48 часов.

Впоследствии ткань обрабатывают согласно описанию в тексте протокола. Репрезентативный результат OFDI представлен на этих изображениях in vivo, полученных из дыхательных путей свиньи при искусственной вентиляции легких. Панель A представляет собой поперечный срез проксимальных дыхательных путей, полученный методом OFDI, а панель B — поперечный срез дистальных дыхательных путей, полученный методом OFDI.

Панель E представляет собой продольный срез дыхательных путей, полученный методом OFDI, где слева расположен проксимальный участок, а справа — дистальный; панель C демонстрирует увеличенное изображение области, выделенной красным цветом на панели E. Панель D представляет собой увеличенное изображение области, выделенной зеленым цветом на панели E. Диаметр катетера составляет 0.8 millimeters, а деления шкалы соответствуют интервалам в 0.5 millimeter. Несмотря на то, что на изображениях OFDI различимы разные слои стенки дыхательных путей и альвеолярные прикрепления, без прямого сопоставления с гистологией затруднительно точно интерпретировать анатомические корреляты сигналов OFDI. E обозначает эпителий, lp — собственную пластинку, SM — подслизистый слой, C — хрящ и a — альвеолярные прикрепления.

Использование продемонстрированного здесь протокола позволяет достичь точной корреляции между OFDI и гистологией. На данном OFDI-изображении дыхательных путей свиньи видна точная корреляция с гистологией срезов ткани, окрашенных гематоксилином и эозином. Снимки отмечены звездочками, указывающими на следы черных чернил, видимые на респираторном эпителии.

Послойное строение дыхательных путей можно визуализировать при окрашивании гематоксилином и эозином (H&E) и трихромным окрашиванием по Массону (Tri-RME). Здесь представлено изображение OFDI с большим увеличением и соответствующая гистология, окрашенная H&E и Tri-RME: E — респираторный эпителий, el — плотная коллагеновая и эластическая ткани, SM — гладкие мышцы, C — хрящевые кольца, G — ткань слюнной железы и D — слюнной проток, входящий в эпителий. Гладкие мышцы выглядят как прерывистые перемежающиеся волокна и, следовательно, не идентифицируются при OFDI.

Аналогично, с помощью маркировки тканей продемонстрирована точная корреляция между OFDI и гистологией дыхательных путей человека. На этом OFDI-изображении проксимальных дыхательных путей человека видны обе метки чернилами, отмеченные звездочками. Наблюдается точная корреляция с гистологией срезов тканей, окрашенных гематоксилином и эозином, а также трихромом в случае окрашивания H и E.

Черные чернильные метки видны на респираторном эпителии, отмеченном звездочкой на изображениях с большим увеличением, полученных с помощью OFDI, и соответствующих гистологических срезах. На вставках представлены изображения, окрашенные гематоксилином и эозином (h and e), а также трихромом (tri CHRO). E обозначает респираторный эпителий, lp — собственную пластинку слизистой оболочки, G — ткань слюнной железы, C — хрящевые кольца и pc — надхрящницу в дыхательных путях человека.

Видно типичное расслоение. В рыхлой соединительной ткани перемежаются пучки гладкомышечных клеток с красным окрашиванием, показанные на панелях C и F; они не образуют непрерывную полосу и, следовательно, не видны как отдельный слой при ОФДИ. Эти два изображения демонстрируют результаты ОФДИ дистальных дыхательных путей человека и точно соответствующие им гистологические срезы h и d.

Черные чернильные метки, видимые на респираторном эпителилии, отмечены звездочками; прикрепления альвеол, отмеченные буквой a, видны в виде интенсивно сигналящих решетчатых стенок альвеол с отсутствием сигнала в просветах альвеол. Сосудистые пространства в собственном слое слизистой также видны как структуры с отсутствием сигнала с легким затененным контуром под ними, отмеченные стрелками. E — эпителий, LP — собственный слой слизистой.

Высокая скорость сбора данных, присущая методу OFDI, позволяет проводить визуализацию больших областей. Данные можно рассматривать как в поперечном, так и в продольном сечении для получения дополнительной информации об архитектуре ткани. После того как с помощью данного метода будут определены характерные признаки визуализации, их можно использовать для интерпретации изображений тех областей, для которых отсутствуют соответствующие гистологические данные.

Данный метод позволяет интерпретировать особенности визуализации с помощью гистологии с прямой привязкой. Хотя эта техника была продемонстрирована на примере OFDI и тканей легкого, ее можно применять ко многим методам визуализации и типам тканей. После того как с помощью данной методики будут определены признаки визуализации нормальных и патологически измененных тканей, эти признаки могут быть использованы для интерпретации изображений in vivo в тех случаях, когда прямая корреляция с данными гистологии может быть недоступна.